明胶是由动物皮肤、骨等结缔组织中的胶原蛋白不完全降解而成的强亲水性蛋白，因其良好的成膜性、胶凝性、乳化性和生物相容性以及低成本和无毒性等优势，已经广泛应用于食品，生物制药及化妆品等领域[1-4]。例如，李媛等[5]利用明胶和迷迭香酸复配成功制备了复合膜，结果表明，将迷迭香酸引入明胶膜，可有效抑制猪肉贮藏过程中挥发性盐基氮含量和菌落总数的上升，且随着迷迭香酸浓度的增加，抑制效果明显增强。FENG等[6-7]以京尼平为交联剂制备了食品级明胶纳米颗粒，并用于稳定Pickering乳液。在本课题组前期的研究中，利用微波和液氮快速的冻融耦合诱导明胶化，且用微波辅助进行明胶的提取[8-9]。然而，明胶经过热风干燥后容易产生不悦气味以及不良颜色。因此，寻找一种新的明胶干燥方法具有重要意义。
近年来，真空冷冻干燥和喷雾干燥因其简单、低成本、高效率、可重复扩大生产以及最大程度减少营养物质的流失等优势被广泛应用于食品物料的干燥中[10-12]。例如，KHASHAYAR等[13]评价了壳聚糖涂层对喷雾干燥固化前后亚麻籽肽组分纳米脂质体稳定性的增强作用。因此，将真空冷冻干燥和喷雾干燥应用于明胶，以减少干燥过程中的不良变化，对绿色明胶的工业化应用具有重要意义。然而，在干燥过程中，能量或热量的输入通常会导致蛋白质的理化和功能特性的改变[14]。一般来说，蛋白质的共价键和非共价键被能量破坏将导致蛋白质的理化性质发生明显变化，极大地影响了蛋白质的溶解度、凝胶化、起泡性、乳化性等功能性质，这进一步影响了蛋白质在工业化中的应用[15-16]。例如，SALEM等[17]研究表明喷雾干燥可改善明胶的起泡性、乳化性以及保水保油性，并提高凝胶强度和玻璃转移温度。然而，目前关于热风干燥、真空冷冻干燥和喷雾干燥对微波液氮快速冻融耦合提取明胶理化性质的影响还没有被系统地研究。
因此，本研究聚焦于热风干燥、真空冷冻干燥和喷雾干燥对明胶的理化性质的影响，包括得率、颜色、凝胶强度、凝胶持水力、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)、疏水性以及傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)。本研究旨在完善明胶的绿色制备方法，以期为绿色明胶的工业化应用提供理论依据和指导。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
大眼金枪鱼皮,山东中鲁远洋食品有限公司慷慨；十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl benzene sulfonate,SDBS)、溴化钾、硫酸铝、氧化镁、磷酸，成都科龙化学试剂厂;4×蛋白缓冲溶液(含二硫苏糖醇)、Tris、考马斯亮蓝R-250、四甲基乙二胺，美国Bio Basic公司；质量分数30%丙烯酰胺， 北京索莱宝科技有限公司；标准蛋白 (分子质量为10～200 kDa)， 加拿大Fermentas公司。其中Tris、考马斯亮蓝R-250、30%丙烯酰胺为优级纯，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
JA3003B电子天平,上海精天电子仪器有限公司;QL 901 Vortex漩涡混合器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;HH-4数显恒温搅拌水浴锅,上海新诺仪器设备有限公司;Heraeus Multifuge X3R台式高速冷冻离心机,美国赛默飞世尔科技公司;MAS-II plus微波合成萃取反应工作站，上海新仪微波化学科技有限公司;DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司;FD-1-50真空冷冻干燥机，中国北京博益康实验仪器有限公司;KQ-100B超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司;YC-510喷雾干燥器，中国上海亚诚仪器设备有限公司;UltraScan-PRO测色仪，美国Hunter Lab公司;TA.XT2i物性测定仪，英国Stable Micro Systems公司;F- 4500荧光分光光度计，日本日立公司;Spectrun100红外光谱仪，美国Perkin Elmer公司。
1.3 鱼皮的准备
参考杜杰等[9]的方法将鱼皮去除脂肪和非胶原蛋白备用。新鲜鱼皮在去除鱼鳞和鱼肉后清洗干净，切成小块(4 mm×4 mm)。在超声(120 W，25 ℃，2 h)条件下，加入2倍体积0.75%(质量分数)的SDBS溶液去除脂肪。然后，将清洁后的鱼皮与6倍体积1%(质量分数)的NaCl混合，搅拌6 h以除去杂蛋白，每隔 2 h 更换1次NaCl溶液。最后，用去离子水冲洗鱼皮，放入聚乙烯袋中并在-20 ℃下贮存备用。
1.4 明胶的提取
将25 g鱼皮与6倍体积去离子水混合，在微波(75 ℃，350 W，270 r/min)下搅拌15 min。然后，将鱼皮滤出，滤液备用，用液氮快速冷冻鱼皮，之后放入滤液中，在30 ℃水浴条件下搅拌解冻。将鱼皮与滤液混合物转移至微波提取容器中，以1∶50的质量比加入6%(质量分数)的硅藻土溶液。然后，用微波加热60 min(55 ℃，350 W，270 r/min)提取明胶。为了获得澄清的明胶，用9.8%(体积分数)的H3PO4调节滤液的pH至5.5，然后加入3%(质量分数)的Al2(SO4)3并在70 ℃搅拌30 min，最后在13 000×g下离心30 min收集上清液(150 mL)用于干燥。(1)热风干燥明胶(hot air drying gelatin,HDG)：将上清液倒入塑料盘中，然后在60 ℃的热风中24 h得到干燥明胶。(2)真空冷冻干燥明胶(vacuum freeze drying gelatin,VDG)：将上清液在-20 ℃下冷冻2 h后进行真空冷冻干燥。(3)喷雾干燥明胶(spray daying gelatin,SDG)：蠕动泵速度为10，入口温度160 ℃，出口温度100 ℃。明胶得率计算如公式(1)所示：
得率
(1)
1.5 色差测试
采用色差仪对明胶的色差进行测定，分别记录L*值(亮度值)、a*值(红度值)和b*值(黄度值)。
1.6 凝胶强度测定
将1 g明胶与15 mL蒸馏水混合，然后在60 ℃恒温搅拌水浴锅中溶解0.5 h，以获得6.67%(质量分数)明胶溶液。将明胶溶液倒入胶冻杯中(直径54 mm，高度60 mm)，并在4 ℃下冷却16 h。使用物性测定仪测定凝胶样品的凝胶强度，探头采用P/0.5，测试速度为1.0 mm/s，触发力为5 g，下压距离为4 mm。
1.7 持水力测定
参考WANG等[18]的方法进行持水力(water holding capacity，WHC)测定。将凝胶样品(10 g)在25 ℃下于5 000×g下离心10 min。凝胶的WHC定义为离心后凝胶质量相对于离心前凝胶质量的百分比。
1.8 电泳测定
参考MA等[19]的方法通过SDS-PAGE测定明胶样品的分子质量分布。在60 ℃水浴条件下，将干明胶溶解到蒸馏水中，使最终明胶溶液质量分数为0.2%。按照V(样品)∶V(上样缓冲液)=3∶1，添加还原性上样缓冲液，涡旋后煮沸5 min，立即冷却上样，上样量15 μL，Marker 10 μL，电泳分离胶和浓缩胶质量分数分别为6%和5%，电流设置为15 mA，当蓝色条带跑到分离胶中时将电流调至25 mA，待条带跑到绿色底部即可停止电泳。流动水下取出电泳胶，加入考马斯亮蓝R-250染色2 h后脱色至条带清晰，在电泳灯上观察明胶分子质量分布。
1.9 疏水性测定
参考曾茂茂等[20]采用荧光探针法测定明胶的疏水性。以荧光强度对明胶的浓度作曲线，以曲线的斜率表示明胶的表面疏水性(H0)。
1.10 FTIR测定
参考DAI等[21]的方法进行FTIR测试。将明胶粉末和溴化钾粉末按照质量比1∶400在玛瑙研钵中充分研磨，至混合粉末无颗粒感，于40 ℃热风干燥箱中烘干12 h后压成薄片，使用Spectrum 100红外光谱仪在4 000～400 cm-1以4 cm-1的分辨率扫描32次。
1.11 数据处理
所有实验至少独立进行3次，数据以平均值±标准偏差表示。利用SPSS Statistics 17.0和Origin 8.0软件进行显著性分析和作图。
2 结果与分析
2.1 得率分析
不同干燥方式对明胶得率的影响如图1所示。HDG、VDG和SDG的得率分别为25.56%、26.85%和22.17%，表明热风干燥和真空冷冻干燥的明胶得率显著高于喷雾干燥(P<0.05)。SDG较低的得率可能与明胶在喷雾干燥室的贴壁行为以及涡旋分离的损失有关[22]。此外，HDG和VDG没有显著的差异(P>0.05)，说明在热风干燥和真空冷冻干燥过程中没有较大的损失[23]。
图1 不同干燥方式对明胶得率的影响
Fig.1 Effect of different drying methods on the yield of gelatin
注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)
2.2 色差分析
明胶的颜色不会影响其功能性质，但会在食品加工过程中影响食品本身的颜色，最终影响食品的感官质量[24]。从图2可以看出，真空冷冻干燥和喷雾干燥可以明显地减少明胶变黄，提高明胶的白度。表1显示了不同干燥方式对明胶颜色参数(L*，a*，b*)的影响。结果表明，VDG和SDG的L*显著高于HDG，尤其是SDG的白度最大，这可能与喷雾干燥过程中溶剂快速蒸发以减少蛋白的氧化有关[25]。此外，真空冷冻干燥和喷雾干燥能显著降低a*和b*值。颜色的变化可能是由干燥过程中氨基酸的美拉德反应引起的。因此，真空冷冻干燥和喷雾干燥能显著降低美拉德反应的程度，改善热风干燥产生的不良色泽，与明胶的直观结果保持一致。
图2 不同干燥方式对明胶外观的影响
Fig.2 Effect of different drying methods on the visual appearance of gelatin
表1 不同干燥方式对明胶颜色参数的影响
Table1 Effect of different drying methods on the color parameters of gelatin
组别L∗a∗b∗HDG79.59±0.19c2.91±0.07a24.8±0.65aVDG92.26±1.07b0.31±0.07c9.57±0.70bSDG103.11±0.15a1.09±0.05b5.23±0.10c
注：L*表示亮度(0为黑色，100为白色)；a*为红绿值(正值为红色，负值为绿色)；b*为黄蓝色值(正值为黄色，负值为蓝色)；同一列的不同字母(a～c)表示显著性差异(P<0.05)
2.3 电泳分析
不同干燥方式对明胶SDS-PAGE的影响如图3所示，所有明胶样品均显示α1带和α2带。与SDG相比，HDG中α带强度明显降低，VDG略微降低。此外，HDG的低分子质量(50 kDa)明显高于其他组。结果表明，明胶分子在长时间热风干燥后发生明显的降解，但低于真空冷冻干燥和喷雾干燥，可能的原因是真空冷冻干燥条件相对温和，一定程度减轻了明胶的降解，而喷雾干燥是一个快速的过程，抑制明胶在干燥过程中的降解。
图3 不同干燥方式对明胶SDS-PAGE的影响
Fig.3 Effect of different drying methods on the SDS-PAGE of gelatin
2.4 凝胶强度分析
不同干燥方式对明胶凝胶强度的影响如图4所示。相比HDG(153.62 g)，SDG表现出最高的凝胶强度值(239.90 g)，VDG次之(200.82 g)，所有明胶均达到国标要求(GB 6783—2013规定明胶的凝胶强度≥ 50 g)[9]。VDG和SDG的凝胶强度较高与明胶中的高分子亚基含量较高有关，高分子亚基更有利于有效地排列或自聚集，形成密集的网络，从而导致凝胶强度的增加[22]；而较多的小分子亚基形成的网络较为疏松，进而降低了明胶的凝胶强度，与电泳结果一致。此外，所有明胶的凝胶强度值低于杜杰等[9]研究(524.40 g)，可能的原因是明胶溶液中高分子亚基在离心过程中发生凝聚而沉淀[26]，导致凝胶强度的降低。
图4 不同干燥方式对明胶凝胶强度的影响
Fig.4 Effect of different drying methods on the gel strength of gelatin
2.5 凝胶持水力分析
不同干燥方式对凝胶持水力的影响如图5所示。相比HDG(85.36%)，SDG表现出最高的凝胶持水力(96.12%)，VDG次之(92.85%)。VDG和SDG的凝胶持水力较高，这与明胶中高分子亚基含量较高有关，高分子亚基更有利于有效地排列或自聚集，形成密集的网络，从而提高了凝胶的持水力。而较多小分子亚基形成的网络较为松散，则降低了凝胶的持水力[18]，与电泳结果和凝胶强度结果保持一致。
图5 不同干燥方式对凝胶持水力的影响
Fig.5 Effect of different drying methods on the WHC of gel
2.6 疏水性分析
蛋白质的疏水性是影响其功能性质的重要参数[27]。不同干燥方式对明胶疏水性的影响如图6所示。HDG、VDG和SDG的H0值分别为57.68，61.77和80.08，说明真空冷冻干燥和喷雾干燥后明胶的亲水性降低，疏水性增强，SDG表现出最强的疏水性，这可能是由于喷雾干燥过程中暴露了更多的疏水基团。此外，与HDG和VDG相比，SDG在图3中显示了更多的亚基(α1、α2和一些小分子亚基)，它们可能具有更多的疏水氨基酸，从而提高了明胶的疏水性[22]。因此，喷雾干燥可使明胶的疏水性增加，这可能更有利于明胶功能性质的改善。
图6 不同干燥方式对明胶疏水性的影响
Fig.6 Effect of different drying methods on the hydrophobicity of gelatin
2.7 FTIR分析
通常，明胶的酰胺A带和B带分别与N—H或O—H拉伸振动和C—H拉伸相关[19]。明胶的酰胺I带与C
O拉伸振动，C—N拉伸和N—H弯曲有关[8]。不同干燥方式明胶红外光谱的影响如图7所示。
图7 不同干燥方式对明胶FTIR的影响
Fig.7 Effect of different drying methods on the FTIR of gelatin
如表2所示，SDG在酰胺A带的波数最低，表明喷雾干燥增加了N—H基团的数量，更多的N—H基团参与了氢键的形成[28-29]，这更有利于明胶在凝胶形成过程中类三螺旋结构的形成，进而增加其凝胶强度[30]。然而，SDG的酰胺B带显示出最高波数，这可能归因于肽链之间NH3基团较高的相互作用[17]。此外，与SDG相比，HDG和VDG中的酰胺I带转移到较低的波数，这意味着长时间的热风干燥和真空冷冻干燥破坏了明胶的部分构象，形成了更多的分子内氢键[31]。因此，喷雾干燥可以减少明胶的破坏，较好地保持明胶的结构，与SDS-PAGE的结果(图3)保持一致。
表2 不同干燥方式对明胶FTIR特征基团频率的影响 单位：cm-1
Table 2 Effect of different drying methods on the frequency of FTIR characteristic groups of gelatin
种类HDGVDGSDG酰胺A带3 373.893 370.393 368.49酰胺B带2 976.432 976.383 047.67酰胺Ⅰ带1 653.961 653.841 659.16
3 结论
喷雾干燥由于在干燥过程中干燥室的贴壁行为以及涡旋分离的损失使得明胶得率较低(P<0.05)，而真空冷冻干燥和热风干燥没有明显的差异(P>0.05)。
由于喷雾干燥是一个快速蒸发溶剂的过程，减轻了明胶在干燥过程中的氧化和降解，增加了明胶的凝胶强度和凝胶持水力。此外，更多的亚基组分可能含有更多的疏水基团以及疏水基团的暴露使得喷雾干燥的明胶显示出最大的疏水性，有利于明胶功能性质的提高。
红外结果表明，喷雾干燥增加了明胶N—H基团参与的氢键，更有利于明胶在凝胶形成过程中类三螺旋结构的形成，赋予明胶更好的凝胶特性，而热风干燥和真空冷冻干燥破坏了明胶的构象。因此，喷雾干燥可能更有利于改善明胶的性质。
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