大蒜属于百合科葱属植物，是一种药食两用草本植物[1]，含有丰富的碳水化合物、有机硫化合物和酚类化合物等，具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖等功效[2]。大蒜的化学成分因品种、产地、气候和种植等条件而有显著性差异[3]。大蒜主要被用作调味品，因其具有强烈的刺激性气味，难以被大多数人所接受，因而降低了大蒜的实际利用率。黑蒜是新鲜大蒜在高温、高湿条件下加工而成，蒜体呈黑色，故名“黑蒜”。黑蒜相比较于大蒜，其辣味和刺激性气味明显降低，口感甘甜，更易受消费者的喜爱。黑蒜具有显著的抗氧化、抗炎[4]、改善心血管功能、降脂[5]、降血糖[6]和保护肝脏[7]等功效。
目前，黑蒜制备工艺多采用变温熟化的方式，目前存在着熟化周期较长(一般为2～3个月)，耗能较大，生产成本较高的问题[8]。物理预处理(如冷冻、高温等)工艺是果蔬加工过程中常用的前处理技术。冷冻可以增强大蒜细胞膜的通透性，高温预处理可以破坏细胞结构，这些预处理工艺均有利于细胞组织液的流出，从而加速黑蒜熟化过程中的美拉德反应，缩短加工时间[9]。微生物预处理也常用于食品加工过程，以期达到过程强化的目的。黑蒜加工产品形式多样，黑蒜产品有独头黑蒜、多瓣黑蒜，黑蒜再制品有黑蒜果酱、黑蒜饮料、黑蒜粉等[10-11]。本研究以物理预处理(冷冻和高温预处理)和微生物预处理工艺制备黑蒜产品，对不同预处理工艺制备的黑蒜产品进行理化指标、活性成分和抗氧化活性分析，为黑蒜产品的研发提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
大蒜，江苏邳州；酵母，中国食品发酵工业研究院有限公司；DPPH，日本TCI公司；甲醇(优级纯)，美国Thermo Fisher Scientific公司；磷酸(色谱级)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine, SAC)、5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF)标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
双温控高低温湿热箱，上海智筹试验仪器设备厂；高速中药粉碎机，瑞安市永历制药机械有限公司；G-100ST超声波清洗机，深圳市歌能清洗设备有限公司；RE 52-99旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；低温冷却液反应浴，巩义市予华仪器有限责任公司；UV-5500PC紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；LY15-9053A电热恒温鼓风干燥箱，上海龙跃仪器设备有限公司；SpectraMax iD5多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；916 Ti-Touch电位滴定仪，瑞士Metrohm公司；FiveEasy Plus pH计，CM-5分光测色计，日本 Konica Minolta 公司；美国Waters e2695型高效液相色谱，Waters 公司。
1.2 方法
1.2.1 黑蒜制备工艺
取无霉变、无腐烂、无机械损伤的大蒜5 000 g，分为4组处理：不进行预处理；-20 ℃冷冻24 h；置于含有107 CFU/mL的酵母菌溶液中预处理2 h；121 ℃高温预处理15 min。然后置于恒温恒湿箱中，(75%湿度、70 ℃)，熟化30 d，每隔5 d取1次黑蒜样品。
1.2.2 黑蒜提取液的制备
将黑蒜去皮剪碎，放置于粉碎机中进行粉碎，取出粉碎后的黑蒜样品5 g放置锥形瓶中，按料液比1∶20(g∶mL)加入体积分数60%的乙醇，设置初始温度40℃、功率600 W下超声提取30 min，6 000 r/min离心15 min后取上清液，再对残渣提取1次，合并上清液，50 ℃旋转蒸干，定容至50 mL，样品保存至-80 ℃ 冰箱中备用。
1.2.3 色度的测定
参照范昊安等[12]的方法，使用分光测色计对黑蒜提取液进行测定，以去离子水为参比溶液,计算色差值ΔE。
1.2.4 褐变程度的测定
参照姜绍通等[13]的方法，将黑蒜提取液稀释10倍后，利用分光测色计进行测定。
1.2.5 总酚含量测定
采用Folin-Phenol法[14]测定黑蒜提取液中总酚含量。
1.2.6 可溶性蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝G250法[15]测定黑蒜提取液中可溶性蛋白质含量。
1.2.7 可滴定酸含量测定
参照GB/T 12456—2008 《食品中总酸的测定》[16]，使用电位滴定仪测定黑蒜提取液的可滴定酸含量，测定结果以乳酸含量(g/100mL)计。
1.2.8 pH的测定
使用pH计测定黑蒜提取液的pH值[17]。
1.2.9 SAC和5-HMF含量测定
采用高相液相色谱法测定SAC和5-HMF含量[18-20]。液相色谱分析条件：Waters e 2695 高效液相色谱仪，色谱柱：Atiantis®T3 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长为 214 nm，V(甲醇)∶V(0.01%磷酸溶液)=10∶90，柱温20 ℃，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。配制浓度分别为2、4、6、8、10 μg/mL的SAC、5-HMF混合标准品，上机检测。SAC标准曲线为：y=926 800x+170 794，R2=0.999 6(x为浓度，单位 μg/mL，y为峰面积)；5-HMF标准曲线：y=606 742x-34 800，R2=0.999 9(x为质量浓度，单位 μg/mL，y为峰面积)。将黑蒜提取液利用0.01%磷酸溶液稀释10倍，过0.22 μm微孔滤膜，上机检测。
1.2.10 抗氧化能力的测定
1.2.10.1 羟自由基清除能力的测定
参照张浩然等[21]方法进行测定，将黑蒜提取液稀释4倍，进行羟自由基清除能力的测定。
1.2.10.2 ABTS自由基清除能力的测定
参照程勇杰等[22]方法进行测定，将黑蒜提取液稀释75倍，进行ABTS自由基清除能力的测定。
1.2.10.3 还原力的测定
参照薛淑龙等[23]方法进行测定，将黑蒜提取液稀释25倍，进行还原力测定。吸光值越高，代表还原力越强。
1.3 数据统计与分析
每组实验均重复3次，采用GraphPad Prism 8.0软件绘制图，结果以平均值±标准差(SD)表示。利用SPSS 22软件进行相关性分析，利用HemL 1.0 软件进行相关性热图分析。
2 结果与分析
2.1 黑蒜制备过程中色度的变化
色泽可以反映黑蒜制备过程中的褐变情况，是衡量黑蒜品质的重要指标。色度ΔE表示黑蒜制品颜色的深浅，其值越大表明颜色越深，褐变程度越深，产品成色越好[8]。如图1所示，0～5 d，不同预处理工艺制备的黑蒜色度显著增加。从第15天开始，色度几乎维持不变。整个熟化过程中，不同预处理组的黑蒜样品色度无显著差异。陈玲[24]研究表明，鲜蒜中的还原糖和氨基酸相互作用，发生羰氨反应，生成类黑精，是使得蒜瓣变黑的主要原因，且反应前期温度越高，褐变速度越快，反应后期，蒜瓣褐变速度趋于平缓。
图1 黑蒜制备过程中色度的变化
Fig.1 Color change of black garlic during preparation
2.2 黑蒜制备过程中褐变程度的变化
黑蒜制备过程中褐变程度的变化如图2 所示，褐变程度呈现出先持续升高后趋于平稳的趋势，发酵第20 天，各预处理组影响褐变的程度为：微生物预处理组>冷冻预处理>对照组>高温高压预处理组。其中，微生物预处理组影响褐变的速率较快，在发酵至第20天时，褐变程度即达到最高值0.711±0.03，表明进行酵母菌的微生物预处理更加有利于褐变的进行。有研究表明低温预处理和高温水煮预处理均可以破碎细胞组织结构，促使糖类物质的分解和还原糖的积累，可以加速美拉德反应，缩短加工时间[25]。在黑蒜的制备过程中，前期适宜的温度加快了各类酶的催化反应，使得大蒜中的大分子物质不停地水解生成小分子物质，如：蛋白质水解为各种氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸含量较多，可溶性糖含量不断增加，释放出更多的酚羟基，多酚含量不断升高[26]，从而加速美拉德反应。与对照组相比，微生物预处理工艺和冷冻预处理在较短的加工时间内，可以较快地达到需要的黑蒜褐变程度，均有利于缩短大蒜的褐变时间。
图2 黑蒜制备过程中褐变程度的变化
Fig.2 Changes of browning degree of black garlic during preparation
2.3 黑蒜制备过程中总酚含量的变化
酚类物质是黑蒜中一种重要的功能性成分，具有典型的抗氧化性活性，是衡量黑蒜品质的重要指标之一。不同预处理制备黑蒜过程中总酚含量的变化如图3所示，随着熟化时间的延长，4种工艺制备的黑蒜样品在发酵过程中总酚含量均呈现出上升的趋势，发酵至第30 天，黑蒜中总酚含量为：微生物预处理发酵组、对照组>冷冻预处理组>高温高压预处理组，其中微生物预处理组和对照组对于总酚含量的积累无显著差异(P<0.05)，黑蒜成熟后，其总酚含量远高于鲜蒜，为黑蒜中的9.55倍。罗海清[27]研究表明黑蒜总酚含量比大蒜总酚含量多了2.11 mg/g。侯笑林等[28]研究表明:采用体积分数50%的乙醇,料液比为1∶20(g∶mL)，60 ℃温度下提取60 min，浸提法提取黑蒜总酚含量的提取量可达1.82 mg/g。
图3 黑蒜制备过程中总酚含量的变化
Fig.3 Changes of total phenols in the process of black garlic preparation
2.4 黑蒜制备过程中可溶性蛋白质含量的变化
黑蒜制备过程中可溶性蛋白质含量的变化如图4所示，随着发酵时间的延长，可溶性蛋白质含量均呈上升趋势。不同预处理后的鲜蒜样品中可溶性蛋白质的含量存在差异，鲜蒜经过酵母菌浸泡之后，表面会带有一些菌种，使得微生物预处理发酵组初始可溶性蛋白含量高于其他组，程方等[29]相关研究表明：啤酒酵母自身菌体所含粗蛋白含量较高，使得添加啤酒酵母发酵的马铃薯渣中的粗蛋白含量较未接菌增加了3.14%；经过高温高压预处理组的鲜蒜，因蛋白质产生热变形，造成可溶性蛋白质含量下降。张誉稳等[30]相关研究表明：紫花苜蓿叶片和根部在高温(30 ℃)胁迫下，可溶性蛋白含量分别在0～6 h下降17.52%和18.51%。在发酵第20天时，4种预处理工艺制备的黑蒜样品在发酵过程中蛋白质含量由大到小为微生物预处理组>对照组、冷冻组>高温高压组。随着熟化时间的延长，可溶性蛋白质逐渐积累，其原因可能是微生物的代谢作用产生了可溶性蛋白质。熟化至第20天，对照组黑蒜中的可溶性蛋白质增加了1.63倍。徐丽华等[31]相关研究表明：在70 ℃发酵15 d后，80 ℃发酵10 d的变温条件下，蛋白质含量逐渐升高，在发酵25 d时，黑蒜蛋白质含量增加3.14 mg/g DW。
图4 黑蒜制备过程中可溶性蛋白质含量的变化
Fig.4 Changes of total protein in black garlic during preparation
2.5 黑蒜制备过程中可滴定酸的变化
可滴定酸是反映黑蒜品质的理化指标之一。不同预处理工艺制备的黑蒜，可滴定酸含量的变化如图5所示。由图可知，随着发酵时间的延长，可滴定酸的含量均呈上升的趋势，发酵至第30天时，可滴定酸含量依次为：冷冻组>高温高压组>微生物预处理组>对照组。发酵至第30天，冷冻预处理组黑蒜的可滴定酸含量为51.5 mg/g，比鲜蒜含量值高41.3 mg/g，可滴定酸含量的增加是黑蒜在口感上呈酸甜的重要原因，可滴定酸含量的升高与发酵过程中乳酸、醋酸等有机酸的生成有关[14]。与对照组相比，在黑蒜制备过程中，微生物预处理组和冷冻预处理工艺均可提高黑蒜产品中可滴定酸含量。
图5 黑蒜制备过程中可滴定酸的变化
Fig.5 Changes of titratable acid in the preparation of black garlic
2.6 黑蒜制备过程中pH的变化
pH也是反映黑蒜制备过程中的重要理化指标之一，不同预处理工艺制备的黑蒜在发酵过程中pH的变化如图6所示。由图6可知，随着发酵时间的延长，pH均几乎呈现直线下降的趋势，与可滴定酸含量的变化呈相反的趋势。黑蒜熟成后，pH值低至4.20±0.01。不同预处理工艺对制备的黑蒜pH无明显差异。有研究表明，黑蒜提取物抗氧化活性随pH值的升高而下降，在pH值7.0以下，其抗氧化活性随pH值的升高下降的程度较慢；在pH 值7以上的环境下，其抗氧化活性下降得较快[32]。因此，在黑蒜的加工过程中，pH的下降更有利于提高其抗氧化性。
图6 黑蒜制备过程中pH的变化
Fig.6 Changes of pH in the process of black garlic preparation
2.7 黑蒜中的SAC、5-HMF的高效液相色谱图
图7为黑蒜中的SAC、5-HMF的HPLC色谱图，样品中SAC的保留时间为5.875 min，5-HMF的保留时间为11.276 min，与标准品的保留时间相一致。
图7 黑蒜样品中的SAC、5-HMF的HPLC色谱图
Fig.7 HPLC chromatograms of SAC and 5-HMF in black garlic
2.8 黑蒜制备过程中SAC和5-HMF含量的变化
SAC是一种水溶性含硫化合物，主要存在于大蒜[33]和洋葱[34]中，其性质稳定，无色无味，具有抗氧化性[35]、提高免疫力、抗肿瘤[36]、预防老年痴呆[37]等功效。在以前的大蒜研究中，研究者多关注于大蒜中脂溶性大蒜素的功效及组分，最近KODERA等[38]研究表明鲜蒜中约有20～30 mg/g的SAC，而BAE等[39]相关研究表明黑蒜中的SAC含量是鲜蒜的5～6倍。不同预处理工艺制备得到的黑蒜，在发酵过程中其中的SAC含量变化如图8所示。由图8可知，随着发酵时间的延长，不同预处理组制备的黑蒜中，SAC含量呈现出明显增加的趋势，其中微生物预处理组、冷冻预处理组和对照组中的SAC含量明显高于高温高压预处理组。SAC与γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutaml transpeptidase，γ-GTP)活性相关，γ-GTP活性受生产温度和SAC组成影响，γ-GTP活性的最佳温度是40 ℃[40]。较低的发酵温度，有利于得到高含量SAC的黑蒜，这也是经过高温高压预处理后得到的黑蒜具有较低含量SAC的原因。
图8 黑蒜制备过程中的SAC含量变化
Fig.8 Changes of SAC content in black garlic during preparation
黑蒜中的5-HMF主要来源于美拉德反应，5-HMF的生成途径为还原糖在高温条件下直接裂解产生[41]或还原糖和氨基酸发生美拉德反应[38]，高浓度的5-HMF 具有一定的神经毒性和遗产毒性[42-45]。不同预处理工艺制备的黑蒜中5-HMF含量的变化如图9所示。由图9可知，在发酵前15 d，不同预处理组中均未检测到5-HMF。发酵15 d后，随着发酵时间的延长，黑蒜制备过程中的5-HMF含量几乎呈现出线性增加的趋势，发酵至第30天，5-HMF含量依次为：对照组>冷冻预处理组>微生物预处理发酵组>高温高压预处理组。目前研究者对HMF的研究，主要集中在蜂蜜、牛乳、酒类等各类食品中[46]，欧盟将蜂蜜中5-HMF的最大限量设定为40 mg/kg，以确保蜜蜂没有遭受过度加热[19]。当 5-HMF 摄入量过高时，会对人体健康有风险，所以一方面需要消费者自身食用量的控制，另一方面可以采取一些调控措施[47]来适当控制其含量。LEE等[19]通过研究没食子儿茶素没食子酸盐浸渍大蒜不同时间，以降低黑蒜中5-HMF的形成，在一定时间内，浸渍时间越长，5-HMF含量降低得越多，且随着老化时间的延长，黑蒜形成过程中5-HMF的含量产生越少。本研究中利用微生物预处理以降低黑蒜制备过程中HMF的含量，也为黑蒜发酵制备过程的安全控制提供了新的思路。
图9 黑蒜制备过程中的5-HMF含量变化
Fig.9 Changes of 5-HMF content in black garlic during preparation
2.9 黑蒜制备过程中抗氧化能力的变化
2.9.1 黑蒜制备过程中羟自由基清除力的变化
不同预处理后发酵制备黑蒜过程中，黑蒜提取物对于羟自由基清除率的变化如图10所示。由图10可知，在发酵第5天时，3种预处理工艺制备的黑蒜样品对羟自由基清除率呈现出迅速升高的趋势；在发酵至10～30 d时，不同样品的羟自由基清除能力呈波动趋势，方晟等[48]对百合酵素发酵过程中的羟自由基清除能力进行测定，发现40 d时清除能力最高，达到55.72%，随后下降至42.50%并趋于稳定。发酵至第30天时，3组样品对羟自由基的清除能力无明显差异。与发酵前的白蒜相比较，黑蒜在发酵过程中产生大量的酚类、黄酮类及多种美拉德反应产物[49]，这些产物均具有较强的抗氧化活性，因此黑蒜对羟自由基的清除能力高于鲜蒜。
图10 黑蒜制备过程中羟自由基清除能力的变化
Fig.10 Changes of hydroxyl radical scavenging ability of black garlic during preparation
2.9.2 黑蒜制备过程中ABTS自由基清除力的变化
ABTS自由基是一种能够稳定存在的自由基，根据样品对ABTS溶液吸光度的影响可以测定其清除自由基的能力[50]。在黑蒜的发酵制备过程中，不同预处理得到的黑蒜样品对ABTS自由基清除力的变化如图11所示，由图11可知，发酵过程中，不同黑蒜样品对ABTS自由基清除力均呈现出上升后趋于稳定的趋势，其中发酵前20 d，不同黑蒜样品对于ABTS自由基清除能力呈现出线性增加的趋势；发酵25 d后，各组样品的自由基清除能力趋于稳定，基本保持在90%以上较强的清除率，微生物预处理组、冷冻预处理组、高温高压预处理组和对照组均有显著性差异(P<0.05)。
图11 黑蒜制备过程中ABTS自由基清除力的变化
Fig.11 Changes of ABTS free radical scavenging capacity during the preparation of black garlic
2.9.3 黑蒜制备过程中还原力的测定
黑蒜发酵制备过程中还原力的变化如图12所示，随着发酵时间的延长，不同预处理工艺制备的黑蒜样品还原力均呈现出先线性增加再缓慢升高的趋势，与ABTS自由基清除能力呈现出相似同的趋势。发酵至第30天时，进行显著性分析结果显示,对照组和3种预处理组之间均有显著性差异(P<0.05)。有研究表明，样品中所含有的多酚含量与其还原力能力强弱呈正相关性[51]，还原力越高代表抗氧化能力越强，发酵黑蒜中含有较多的多酚、SAC等活性成分，从而表现出较强的抗氧化活性。
图12 黑蒜制备过程中中还原力的变化
Fig.12 The change of reducing force during the preparation of black garlic
2.10 相关性分析热图
以不同预处理工艺后的鲜蒜为原料，进行发酵制备黑蒜，黑蒜中的各种活性成分可能都有助于其抗氧化活性的发挥。为了研究黑蒜中不同的理化指标、功效成分与抗氧化之间的关系，进一步地对黑蒜发酵过程中各理化指标(色差、褐变程度、总酚含量、蛋白质、可滴定酸、pH、SAC含量、5-HMF含量)与抗氧化活性(羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率、还原力)进行相关性分析，结果如图13～图16所示。由图可知，不同预处理后发酵制备的黑蒜产品，其主要的理化指标与抗氧化指标之间均表现出明显的正相关性(pH指标除外)，表明了各种理化指标均对于抗氧化效应具有贡献。不同预处理组的黑蒜色差、褐变程度、总酚、蛋白质、可滴定酸、SAC、5-HMF与ABTS、还原力之间存在显著的相关性(P<0.05)；不同预处理工艺发酵制备的黑蒜褐变程度、总酚、蛋白质、可滴定酸、5-HMF与羟自由基清除能力具有正相关性，但不显著。通过相关性分析热图，进一步揭示了黑蒜中的主要活性成分是其具有较强抗氧化活性的主要原因。
图13 对照组各理化指标与抗氧化活性的相关性 分析热图
Fig.13 Thermogram of correlation analysis between physical and chemical indexes and antioxidant activity in control group
图14 冷冻预处理组各理化指标与抗氧化活性的 相关性分析热图
Fig.14 Thermogram of correlation analysis between physical and chemical indexes and antioxidant activity in freezing group
图15 微生物预处理组各理化指标与抗氧化活性的 相关性分析热图
Fig.15 Thermogram of correlation analysis between physicochemical indexes and antioxidant activity in bacterial liquid group
ΔE-色差;BD-褐变程度;TPC-总酚含量;Pr-蛋白质; TTA-可滴定酸;pH-pH 值;H-羟自由基清除率; ABTS-ABTS 自由基清除率;RP-还原力;SAC: S-烯丙基-L-半胱氨酸;5-HMF-5-羟甲基糠醛
图16 高温高压预处理组各理化指标与抗氧化活性的 相关性分析热图
Fig.16 Thermogram of correlation analysis between physical and chemical indexes and antioxidant activity in high temperature and high pressure group
3 结论
本研究利用不同的预处理工艺制备黑蒜，并对其理化指标和抗氧化相关性进行分析，研究结果表明：经微生物预处理、冷冻预处理、高温高压预处理后制备的黑蒜，在发酵过程中，其色差、褐变程度均呈现出先上升后趋于稳定的趋势；总酚、可滴定酸酸、可溶性蛋白质等物质均呈现出上升的趋势，与相关的抗氧化指标呈现出正相关的趋势；不同工艺制备的黑蒜所含有的SAC含量均高于鲜蒜，经过预处理后，显著降低了黑蒜中的5-HMF含量。与对照组相比，微生物预处理再发酵制备黑蒜，有利于缩短大蒜的褐变时间，提高黑蒜中总酚、可溶性蛋白的含量，降低5-HMF含量；冷冻预处理可以缩短大蒜褐变时间，提高黑蒜中可滴定酸含量，降低黑蒜形成过程中的5-HMF；高温高压预处理可有效降低5-HMF的含量。
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