环糊精(cyclodextrin，CD)在自然界中主要由芽孢杆菌属细菌利用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC2.4.1.19)催化淀粉而得到的不同聚合度的环状低聚葡萄糖[1-2]。CGTase属于糖基水解酶家族13，是一种具有4种催化反应的多功能酶，其中包含歧化、环化和偶联3个转糖基化反应和水解反应[3]。由于其转糖基活性远大于水解活性，被归属于转移酶类。该酶催化常见产物有6、7、8个葡萄糖基组成的α-、β-和γ-CD[4]，以及更高聚合度的大环糊精[5-6]。环糊精结构呈“甜甜圈”状，具有内部疏水空腔和亲水表面，可以与客体分子形成包合物，由于这一独特的性质，CDs可以与广泛的固体、液体和气体化合物形成分子包合物(主客体复合物)，提高了分子的稳定性、溶解性、反应性和生物利用度[7]，在食品、医药、分析化学、农业等领域有着广泛的应用[8]。
β-CD产量高价格便宜，但溶解性差。γ-CD是一种备受关注的CD，因为它具有更大直径的空腔，这使得它可以与更大分子形成包合物。同时，它在25 ℃水中的溶解度是α-CD的1.6倍，更是β-CD的12.54倍，这有利于制备更高浓度的活性溶剂[9]。但由于其产量低、价格高，应用受到极大的限制。因此，获得新的CGTase对γ-CD的生产具有重要的科学意义和实用价值。
目前，用于合成γ-CD的主要微生物有Bacillus sp.G-825-6[5]、Bacillus macorous [10]、Bacillus thuringiensis[11]和Bacillus clarkii 7364[12]等。由于野生菌种遗传背景复杂，不易调控且CGTase酶表达量低等缺陷，研究者们正通过基因工程技术构建高表达、高产物特异性的工程菌种。用于表达的系统主要有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌[13]和毕赤酵母[14]表达系统，其中大肠杆菌是目前应用最广泛的CGTase表达系统[15]。已报道的γ-CGTase共有8种[16]，来源不同的γ-CGTase存在产物特异性差异大、淀粉转化率低、产物中γ-CD占比低等不足，为后续γ-CD纯化带来不便。因此，γ-CGTase的自然筛选、分子改造以及催化工艺条件优化成为研究热点[17]。
本实验通过克隆来源于Bacillus clarkii 7364的γ-CGTase基因，将其与pET28a(+)质粒连接，并转化到大肠杆菌(E.coli BL21)中进行表达。研究该酶的酶学性质和产物特异性，为获得γ-CGTase的工业化应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌株和质粒：E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒 pET28a(+)均为本实验室保存。
LB培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，121 ℃灭菌20 min。
主要试剂：质粒提取试剂盒、Fast Mutagenesis System试剂盒、胶回收试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白纯化Ni-IDA Resin、FastPfu DNA 聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ，北京全式金生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物，英国Oxoid公司；异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，美国Sigma公司；硫酸卡纳霉素，上海雅吉生物科技有限公司；α-CD、β-CD、γ-CD标准品(色谱纯)，上海生工生物工程有限公司；可溶性淀粉等均为国产分析纯或生化试剂，其他淀粉为食品级。
1.2 仪器与设备
ZHWY-2102恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；DYY-5电泳仪，北京市六一仪器厂；TC-96/G/H(b)C PCR仪，杭州博日科技有限公司；Tanon 1600凝胶成像系统，安徽省鑫源祥生物技术有限公司；KS-150超声波细胞破碎仪，大庆仪器公司；Avanti J-E高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；D-37520 1-14k小型离心机，德国Sigma离心机公司；Master touch-DUF超纯水制备仪，上海和泰仪器有限公司；示差折射率检测器，Shodexl永城仪器公司；X-Amide高效液相色谱柱，华谱科仪(北京)科技有限公司等。
1.3 实验方法
1.3.1 重组菌构建
通过NCBI查询获得来自于Bacillus clarkii 7364的γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因(NCBI登录号为BAH14968.1)，由苏州金唯智生物科技有限公司完成基因合成。以合成的目的酶基因序列为模板设计引物，正向引物序列′-GAAACACGGATCCGCGACCCATTTGC-3′和反向引物序列5′-TTCGCCGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTG
CTAACAAA-3′，以pET-28a(+)为载体，得到连接产物pET-28a(+)-γ-CGTase转化至E.coli DH5α感受态中，提取质粒酶切和测序验证。将测序正确的重组质粒通过热转化法转入到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)内，最终获得E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase重组基因工程表达菌株。
1.3.2 酶蛋白表达
将构建好的重组菌株E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase和对照菌株E.coli BL21/pET28a(+)分别以2%(体积分数)接种量接种于100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37 ℃、220 r/min条件下培养至OD600达到1.8～2.0后，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG诱导，于25 ℃、200 r/min环境中表达培养8 h。在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心15 min获得菌体，用0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠(pH 10)洗涤细胞。将重悬菌液于冰浴中超声波破碎15 min，于4 ℃、6 000 r/min离心15 min获得粗酶液，用于后续实验。
1.3.3 酶蛋白分离纯化
将粗酶液用镍亲和凝胶柱纯化，分别收集80～200 mmol/L咪唑洗脱液。选择最佳咪唑洗脱浓度洗脱，洗脱液用5 000 Da透析袋透析24 h去除咪唑等杂质，收集透析酶液。随后用聚乙二醇进行酶液浓缩，得到纯化酶液。采用SDS-PAGE和Bradford法进行酶分子质量、酶蛋白浓度测定，计算每步纯化后比活力和活力回收率。
1.3.4 酶活力测定方法
该酶有环化、耦合、歧化、水解反应，而环化能力是该酶的主要特性，为了分析酶催化机制，因此测定该酶的γ-环化活力和水解活力。
1.3.4.1 酶水解活力测定
参照花敬涵[18]蓝值法略有改动。取稀释酶液10 μL加入200 μL质量分数为0.2%的可溶性淀粉溶液，在40 ℃，pH 10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中反应10 min后，加入0.5 mol/L的冰乙酸500 μL结束反应，最后加入质量分数为0.005%的碘液3 mL显色，样品在700 nm下测定吸光度(以等量缓冲液代替淀粉溶液为空白对照)，酶活力计算如公式(1)所示：
酶活力
(1)
式中：ODA，未加酶液吸光度；ODB，加入酶液吸光度;n，稀释倍数。
一个酶活力单位定义为使吸光度下降10%的酶量。
1.3.4.2 γ-环化活力测定
反应条件：1 mL质量分数为2%淀粉，10 μL酶液，pH 10，40 ℃，催化30 min。反应结束，沸水热烫5 min，12 000 r/min离心10 min后去除沉淀，吸取上清液过0.22 μm滤膜，HPLC法检测并用外标法计算产量。
色谱条件：液相检测器为示差折射率检测器，X-Amide 酰胺色谱柱(4.6 mm×250 mm)；色谱柱温度为25 ℃，流动相是体积分数为65%乙腈/蒸馏水，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。
酶活力单位定义：1 min生成1 mg γ-CD所需加酶量为1个酶活力单位(U)。参照郑丹妮等[16]的方法。
标准曲线测定：精密称取0.50 g γ-CD标准品，以蒸馏水将其定容于25 mL容量瓶中，配制成20 mg/mL的母液。分别用蒸馏水稀释至γ-CD终质量浓度为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL的梯度溶液，使用上述HPLC条件检测，以标准品浓度为横坐标，HPLC得到的γ-CD峰面积为纵坐标，通过Origin软件线性分析得出标准曲线方程。得回归线性方程Y=244 890X+40 766(R2=0.999 2)，线性范围为2～20 mg/mL。在此范围内，γ-CD含量与峰面积呈正相关。
1.3.5 γ-CGTase最适温度及温度稳定性测定
最适温度：将酶反应温度设置在35～80 ℃，按1.3.4的方法操作，测定酶的最适温度。将最大相应酶活力定为100%，分别计算相对酶活力。
温度稳定性：将酶置于不同温度下孵育，隔不同时间测定相应酶活力。将初始酶活力定为100%，分别计算相对酶活力，考察该酶γ-环化与水解活力的温度稳定性。
1.3.6 γ-CGTase最适pH及pH稳定性测定
最适pH：该酶来自于碱性芽孢杆菌，因此本实验设计考察pH为7～13。配制0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，利用pH计调节各个缓冲液。用不同pH缓冲液配制2%(质量分数，下同)可溶性淀粉为底物溶液，测定酶活力。将最大酶活力定为100%，分别计算相对酶活力。
pH稳定性：配制0.05 mol/L pH 4～13的缓冲溶液(pH 4～7乙酸-乙酸钠缓冲液，7～13甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，纯化酶用不同pH缓冲液稀释，于4 ℃冰箱保存1、24 h，测定酶活力，24 h与1 h酶活力之比，计算保留酶活力，考察该酶γ-环化与水解活力的pH稳定性。
1.3.7 金属离子对γ-CGTase酶活力影响
用超纯水分别配制50 mmol/L的NH4Cl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、NiCl2、CuSO4、BaCl2、MnSO4、ZnCl2、FeCl3、Al2(SO4)3和EDTA溶液，稀释至使其在酶促反应中终浓度为1 mmol/L，测定酶活力，以等量超纯水代替金属离子液为对照100%，计算相对酶活力，比较上述金属离子对酶活力的影响。
1.3.8 动力学参数测定
以可溶性淀粉为底物，利用双倒数法Lineweaver-Burk测定γ-CGTase反应动力学参数。测量0.4%～2%不同底物质量分数溶液下γ-CGTase的γ-环化活力。酶反应动力学曲线用纵坐标(1/υ)横坐标(1/[S])作图，即可得到酶反应动为学参数。
1.3.9 乙醇体积分数对γ-CD产量的影响
以2%可溶性淀粉为底物，酶添加量为3.35 U/g(环化酶活力/干淀粉)，终体积分数为0、5%、10%、15%、20%、25%的乙醇，在50 ℃、pH 10的条件下催化6 h，HPLC法测定产物。
1.3.10 底物种类对产物特异性影响
分别配制2%葛根淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉和可溶性淀粉为考察对象。
反应体系：1 mL 2%不同种类的糊化淀粉为底物，酶添加量为3.35 U/g(环化酶活力/干淀粉)，50 ℃，pH 10，反应6 h。反应结束，沸水热烫5 min，12 000 r/min 离心5 min，过膜，检测γ-CD。
1.3.11 数据分析及处理
每组平行测定3次，标准偏差以误差线的形式表示，利用Origin软件对结果进行统计分析并作图。
2 结果与分析
2.1 E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase重组菌株构建与表达
2.1.1 重组菌株构建
将PCR扩增的γ-CGTase基因与载体pET28a(+)片段用无缝克隆技术与相同酶切位点的载体pET28a(+) 相连接，通过42 ℃热击转化感受态E.coli DH5α细胞。经菌落PCR验证并提取转化子的质粒分别用限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切验证。结果与理论片段大小相符，表明重组菌株E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase构建成功。
2.1.2 γ-CGTase的表达与纯化
重组菌株在25 ℃、200 r/min、终浓度为0.3 mmol/L的IPTG条件下诱导8 h，可达到蛋白可溶性表达。图1-a中，在加0.3 mmol/L IPTG诱导剂重组菌株破碎细胞上清液中明显可以看到70 kDa处有目的蛋白表达，与预测蛋白大小(78 kDa)一致。
M-蛋白质Marker，1～4-80、120、160和200 mmol/L咪唑洗脱液a-重组菌蛋白表达;b-重组菌γ-CGTase纯化
图1 重组菌产酶SDS-PAGE分析
Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant becteria production
由图1-b可知，在70 kDa Marker附近处有唯一条带，γ-CGTase由702个氨基酸组成，分子质量约为78 kDa，与理论值一致。200 mmol/L咪唑为最佳洗脱浓度，通过逐步纯化得到纯化酶，测定结果见表1(水解活力)。细胞破碎离心得到的上清液为粗酶液，由于是细胞内表达，会含有较多的宿主蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化，γ-CGTase蛋白上含有6×His标签，可以有效去除杂蛋白，但由于亲和结合达饱和，也会使γ-CGTase蛋白未能充分结合而丢失，导致纯化后活力回收率低。透析可以有效去除咪唑等小分子物质，再通过聚乙二醇脱水浓缩，使得酶活力回收率基本保持无损失。
表1 γ-CGTase蛋白纯化
Table 1 The purification of the γ-CGTase
纯化步骤体积/mL酶活力/(U·mL-1)蛋白含量/(mg·mL-1)比活力/(U·mg-1)纯化倍数活力回收率/%粗酶25753.36594.91.271100Ni-NTA亲和层析20149.0521.017.095.6015.83
2.2 γ-CGTase的酶学性质
2.2.1 温度对酶活力的影响
2.2.1.1 γ-CGTase的最适温度
γ-CGTase具有环化、耦合、歧化、水解4种催化功能，环化功能是其主要功能。从图2可知，γ-CGTase的水解最适温度比γ-环化最适温度范围窄。随温度升高酶水解活力增强，当65 ℃时达到最大活力，随着温度上升酶活力急剧下降。而γ-CGTase的γ-环化活力的最适温度范围较宽，60 ℃为最适温度，40～65 ℃均有较高的酶活力，相对酶活力保持在近90%或以上。
图2 γ-CGTase的最适温度
Fig.2 The optimal temperature of the γ-CGTase
2.2.1.2 γ-CGTase的温度稳定性
由图3可知，γ-CGTase的水解热稳定性比γ-环化稳定性弱。40 ℃时，该酶的水解活力在8 h为63%，而γ-环化活力仍保持在95%以上。50 ℃时，水解活力8 h已达半衰期，而γ-环化活力仍保持在60%左右。随着温度再次升高，两种活力均出现下降，但在高温条件下γ-环化活力的衰退速度比水解活力衰退得慢。由此可得出，γ-CGTase的γ-环化活力热稳定性比水解活力强。
a-水解热稳定性;b-γ-环化热稳定性
图3 γ-CGTase的水解和γ-环化热稳定性
Fig.3 The temperature stability of the hydrolysis and cyclization activity of the γ-CGTase
2.2.2 pH对酶活力的影响
2.2.2.1 γ-CGTase的最适pH
pH对酶的催化活性有较强影响。由图4可知，γ-CGTase的水解最适pH比γ-环化最适pH偏碱。γ-CGTase的水解最适pH为12，在pH 11～13有较稳定的水解活力，而γ-CGTase的γ-环化最适pH为10，pH对γ-环化活力的影响比水解活力大。
图4 γ-CGTase的最适pH
Fig.4 The optimal pH of the γ-CGTase
2.2.2.2 γ-CGTase的pH稳定性
γ-CGTase属于碱性酶。由图5可知，在pH>6环境中有较好的稳定性，24 h后两种酶活力仍可保留在60%以上。当pH低于5时，明显可见酶蛋白出现沉淀，活力急剧下降，水解活力基本消失。经软件分析，该酶的pI为4.59，因此出现蛋白质沉淀现象，与测算结果表现一致。γ-CGTase水解活力最高稳定条件在pH 11～13，γ-环化活力最高稳定条件在pH 9～10，两者存在差异。因此该酶催化的最佳pH(环化活力)为9～10，符合碱性芽孢杆菌来源酶的特性。
a-水解pH稳定性；b-γ-环化pH稳定性
图5 γ-CGTase的水解和γ-环化pH稳定性
Fig.5 The pH stability of the hydrolysis and cyclization activity of the γ-CGTase
2.2.3 金属离子对酶活力影响
不同金属离子对γ-CGTase活力的影响见图6。金属离子Ca2+、Mg2+对该酶的两种酶活力均有促进作用，提高约10%的酶活力，Zn2+、Mn2+和Al3+对该酶的水解活力有明显的抑制作用，使该酶水解活力丧失20%～40%不等，而对γ-环化活力影响较小。Ca2+激活作用主要是因为γ-CGTase也属于α-淀粉酶家族中的成员。
a-金属离子对γ-CGTase的水解活力影响；b-金属离子对γ-CGTase的γ-环化活力影响
图6 金属离子对γ-CGTase酶活力影响
Fig.6 Effect of metal ions on the enzyme activity of the γ-CGTase
2.3 酶动力学参数测定
以γ-环化活力为依据，进行测定计算。米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)是酶非常重要的动力学参数。从Km可以判断底物和酶的亲和关系，Vmax可以判断出酶的催化效率。通过计算，该酶的Km为(50.42±2.45) mg/mL，Vmax为(1.36±0.68) mg/(mL·min)。与郑丹妮等[16]研究的来源于Bacillus sp. FJAT-44876动力学参数相比，Vmax值较高，说明该酶催化能力较强。
2.4 乙醇体积分数对γ-CD产量的影响
适合的乙醇体积分数对环糊精葡萄糖转移酶有促进作用，不仅可以提高目标产物的产量，也可以提高产物专一性。图7中α-CD、β-CD和γ-CD标准品的质量浓度均为10 mg/mL。由图可知，该酶产物中没有α-CD，主产γ-CD。10%乙醇体积分数的反应体系，不仅γ-CD产量增加了89.91%，而且γ-CD/β-CD由7.70提高至13.38，增大了73.77%，使得γ-CD的合成比率达到93.05 %。因此，乙醇对该酶也具有提高产物产量和增强特异性效果。
图7 乙醇对γ-CGTase催化产物特异性的影响
Fig.7 Effect of ethanol on enzyme catalytic specificity of γ-CGTase
不同的环糊精葡萄糖基转移酶对乙醇体积分数要求不同，郑丹妮等[16]研究Bacillus sp.FJAT-44876来源的γ-CGTase最佳乙醇体积分数为10%，花敬涵[18]研究的Bacillus cereus来源的β-CGTase最佳乙醇添加量为25%，换算乙醇体积分数应为20%。如图8可见，随着乙醇体积分数增加，γ-CD产量增加，当乙醇体积分数达到15%时，产量达最大值。随着乙醇体积分数增加，淀粉的溶解度受到影响，降低了淀粉利用度。原因如同王亮等[19]的解释，乙醇可提高酶的催化效率，添加适量的乙醇可以增加CGT酶与淀粉的结合位点提高其环化作用的效率，同时减少酶表面的水分含量或受体分子的量来阻碍CGT酶对CD的降解，对于偶合反应和水解反应起到一定的抑制作用，最终使CD的产率得到提高。
图8 乙醇体积分数对γ-CGTase催化产物γ-CD产量影响
Fig.8 Effect of ethanol concentration on the γ-CD production of the γ-CGTase
2.5 底物种类对产物特异性影响
由图9可知，γ-CGTase催化不同淀粉的产物特异性不同。以豌豆淀粉为底物，得到的γ-CD/β-CD为12.92，且γ-CD转化率最高19.10%。与可溶性淀粉相比，可溶性淀粉的γ-CD/β-CD是7.92，γ-CD转化率是15.54%，分别提高了63.13%和22.90%。其次是木薯淀粉、葛根淀粉和小麦淀粉均比可溶性淀粉和玉米淀粉的γ-CD转化率高。而γ-CD/β-CD与γ-CD转化率并不一致，葛根淀粉≈木薯淀粉>豌豆淀粉≈玉米淀粉>小麦淀粉≈可溶性淀粉。因此，不同淀粉的组成和结构对γ-CGTase催化产物特异性有较大影响。
图9 不同淀粉催化后γ-CD转化效果比较
Fig.9 Comparison of conversion effects of γ-CD from different starches
MATIOLI等[20]以麦芽糊精、大米、马铃薯、木薯、玉米淀粉为底物，结果表明玉米淀粉是生产γ-CD的最佳底物。王磊[21]比较了玉米、马铃薯、木薯和可溶性淀粉，结果表明马铃薯淀粉与可溶性淀粉优于其他淀粉。王金鹏等[22]同样对比了玉米、马铃薯、木薯和可溶性淀粉，结果却显示木薯淀粉>玉米淀粉>马铃薯淀粉>可溶性淀粉。这些差异主要与γ-CGTase酶和不同淀粉颗粒作用方式不同有关。BENAVENT-GIL等[23]通过研究CGTase酶催化玉米和马铃薯淀粉作用机理，发现玉米淀粉和马铃薯淀粉水解导致颗粒表面不同，玉米淀粉表面有序性和结晶度低，从而更有利于CGTase酶对玉米淀粉的催化作用。关于不同淀粉与CGTase酶的催化效果尚存在争议，应从不同淀粉组成与结构上分析酶催化机制。
3 结论
本研究克隆来源B.clarkii 7364的γ-CGTase基因并构建了1株E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase 重组菌。经IPTG诱导镍柱纯化，SDS-PAGE测得γ-CGTase分子质量为78 kDa，其水解与环化活力趋势相同，但存在差异。水解酶的活力测定方法快速简便，可以用于酶活力表达测试。γ-CGTase的环化活力比水解活力高，且温度稳定性强，而适碱性则水解活力比环化活力高，环化活力最适条件为9～10。该酶催化各种淀粉产物中几乎无α-CD，主产物为γ-CD，属于γ-CGTase。乙醇对该γ-CGTase具有提高催化效率、增强产物特异性作用，10%乙醇体积分数可提高γ-CD产量89.91%，γ-CD/β-CD提高73.77%，使得γ-CD的合成比率达到93.05%。不同淀粉做催化底物,制备γ-CD的能力有较大差异。综合比较，豌豆淀粉表现出较明显优势，γ-CD纯度较高且转化率明显高于其他淀粉。虽然通过添加有机溶剂和筛选底物可以有效提高γ-CD产量和质量，但是γ-CD转化率低仍然是实验中存在的主要问题。后续可通过进一步优化催化条件，提高γ-CD转化率，为酶法制备γ-CD提供科学的参考依据。
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