紫穗槐蜂蜜是蜜蜂以紫穗槐(Amorpha fruticosa)为主要蜜源植物酿造而成的一种中国特色蜂蜜，其一般流蜜季节为5～6月，多产自中国西北地区[1]。紫穗槐蜜呈紫红色，又称“血蜜”，可有效预防酒精性胃溃疡[1]，其种植面积少，产量低，是较为稀缺的特色小蜜种。蜂蜜的理化指标是评价其质量品质和营养价值的重要指标，主要包括水分、酸度、5-羟甲基糠醛、淀粉酶值、还原糖、蔗糖等。目前已有对大宗蜜种如枣花蜜[2]、椴树蜜[3]、荆条蜜[4]、洋槐蜜[5]及部分小蜜种如枇杷蜜、薰衣草蜜[6]和麦卢卡蜂蜜[7]等理化指标的报道，但国内外尚缺乏紫穗槐蜂蜜理化指标的系统性数据。蜂蜜的风味主要与挥发性成分有关，挥发性成分不仅是影响蜂蜜口感和品质的重要因素，而且大量数据表明挥发性成分可作为蜜种鉴别的依据[8-9]。JERKOVI
等[10]发现紫穗槐蜜中主要挥发性成分为苯乙醇、芳樟醇氧化物和丁香酸乙酯，但针对我国紫穗槐蜂蜜的挥发性成分研究尚未见报道。
本研究采用现有标准方法对紫穗槐蜜的理化指标(水分、酸度、淀粉酶值、5-羟甲基糠醛、还原糖、蔗糖)进行测定，采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱(headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)技术对紫穗槐蜂蜜的挥发性成分进行测定，对其理化指标和挥发性成分组成进行了系统分析，对紫穗槐蜂蜜的质量和品质特征情况进行了综合评价。
1 实验部分
1.1 蜂蜜样品
研究所用蜂蜜样品均是在紫穗槐植物开花流蜜时节(5～6月)采集，其中7份采自中国陕西，1份采自中国山西。紫穗槐蜜为小蜜种蜂蜜，其产情受年份影响较大，因而样品采集自产情较好的2017年和2019年(表1)。
表1 紫穗槐蜂蜜样品采集信息表
Table 1 Sample information of collected Amorpha fruticosa honeys
样品编号采集地点采集时间No.1中国陕西2017.05No.2中国陕西2017.05No.3中国陕西2017.05No.4中国陕西2019.05No.5中国陕西2019.06No.6中国陕西2019.05No.7中国陕西2019.06No.8中国山西2019.05
1.2 试剂与材料
XBridge BEH Amide色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美国Waters公司；HP-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，美国Sepax Technologies公司；DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维，美国Sigma-Aldrich Supelco公司，实验前在270 ℃条件下，老化30 min；20 mL顶空瓶，配置硅胶/聚四氟乙烯隔垫和20 mm铁盖，德国Gerstel公司；压盖器和启盖器，德国CNW公司。
甲醇(≥99.9%)、乙腈(≥99.9%)，均为色谱纯，北京迪科马科技有限公司；碘(≥99%)、KI(≥99%)、NaCl(≥99.5%)、乙酸钠(≥99%)、可溶性淀粉，均为分析纯，天津永晟精细化工有限公司；冰乙酸(≥99.7%)，美国Tedia有限公司；实验用水为超纯水。标准物质：5-羟甲基糠醛(≥99%)，美国Sigma-Aldrich Supelco公司；果糖(≥99%)、葡萄糖(≥99.5%)、麦芽糖(≥98.0%)，上海阿拉丁公司；蔗糖(≥99%)，国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器设备
7890B—5977B型气相色谱-质谱联用仪，配置分流/不分流进样口和固相微萃取专用衬管，美国Agilent公司；MPS多功能样品前处理平台，配置自动化顶空固相微萃取手柄，德国Gerstel公司；ACQUITY超高压液相色谱仪(配紫外检测器)、S2690液相色谱仪(配置示差检测器)，美国Waters公司；ARIAS500阿贝折光计，美国REICHERT公司；UV-2600紫外分光光度计，日本岛津公司。
1.4 实验方法
1.4.1 紫穗槐蜂蜜理化指标的测定
水分含量测定参照SN/T 0852—2012《进出口蜂蜜检验规程》附录A水分的测定；酸度测定参照SN/T 0852—2012《进出口蜂蜜检验规程》附录B酸度的测定；还原糖含量测定参照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》；淀粉酶值测定参照GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法 分光光度法》；5-羟甲基糠醛测定参照GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羟甲基糠醛的测定方法 液相色谱紫外检测法》。
1.4.2 紫穗槐样品挥发性成分测定
样品处理：准确称取(2.0±0.1) g蜂蜜样品于20 mL顶空瓶中，密封后置于样品前处理平台上进行固相微萃取。
固相微萃取条件：采用实验室先前优化建立的分析方法[11]，萃取纤维选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取温度60 ℃；萃取时间45 min；平衡时间10 min；振荡速率250 r/min；进样口解析时间5 min。
色谱条件：色谱柱为Agilent DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升温程序：初始温度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升温至160 ℃，然后以10 ℃/min升温至270 ℃，保持6 min，总运行时间为60 min。载气为高纯氦，流量1.0 mL/min；进样口温度270 ℃，进样方式为不分流进样。
质谱条件：电子轰击离子源(electron impact，EI)70 eV，离子源温度230 ℃；传输线温度270 ℃；全扫描模式，扫描范围m/z 25～450。
定性定量方法：将各组分质谱图经NIST14谱库检索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物计入结果，同时应用保留指数(retention index，RI)值、标准品验证辅助定性。采用面积归一化法测定样品中挥发性成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 紫穗槐蜂蜜的主要理化指标
蜂蜜的理化指标是评定蜂蜜品质的重要因素之一。利用国家现有标准方法对8批紫穗槐蜜的理化指标(水分、酸度、淀粉酶值、5-羟甲基糠醛、还原糖、蔗糖)进行测定。结果如表2所示。
表2 紫穗槐蜂蜜主要理化指标
Table 2 Physicochemical parameters of A.fruticosa honeys
编号No.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8水分含量/%17.317.817.417.315.516.515.716.5酸度/(mL·kg-1)22.516.822.522.325.814.818.516.7酶值/[mL·(g·h)-1]27.246.55755.770.641.250.865.1羟甲基糠醛/(mg·kg-1)28.7————3.03.5—果糖/%40.740.340.040.538.740.839.243.1葡萄糖/%27.626.130.130.028.828.926.728.1蔗糖/%0.041.630.330.241.151.852.420.00果糖+葡萄糖68.266.470.170.567.469.665.971.1果糖/葡萄糖(fructose/glucose,F/G)1.471.551.331.351.341.411.471.54
水分含量是鉴别蜂蜜质量的指标之一，是评价蜂蜜自然成熟度的标准[12]。水分含量过高，蜂蜜会产生一定程度的发酵，进而会影响其感官和品质。成熟蜂蜜的水分含量一般在20%以下[12]。由表2知，紫穗槐蜂蜜的水分含量为15.5%～17.8%，平均值为16.8%，表明8批紫穗槐蜂蜜均为自然成熟蜂蜜，达到行业标准GH/T 18796—2012《蜂蜜》(以下简称GH/T 18796)规定的一级蜜水平。
蜂蜜的酸度与有机酸和无机离子有关。酸度大小会一定程度上影响蜂蜜的抗菌活性[13]。GH/T 18796中规定蜂蜜的酸度<40 mL/kg，紫穗槐蜂蜜的酸度范围为14.8～25.8 mL/kg，平均值为20.0 mL/kg，符合标准要求。
淀粉酶值是反映蜂蜜新鲜度和营养功能的重要指标，该酶与蜂蜜中糖类的转化密切相关[14]。GH/T 18796中规定淀粉酶值≥4 mL/(g·h)。由表2可知，紫穗槐淀粉酶值范围为27.2%～70.6%，平均含量高达51.8%，不仅符合标准要求，且明显高于枣花蜜[2]、荆条蜜[4]、油菜蜜[15]和椴树蜜[3]等大宗蜜源蜂蜜的淀粉酶值(图1)。
图1 紫穗槐蜂蜜与大宗蜂蜜淀粉酶值含量对比图
Fig.1 Amylase activity of A.fruticosa honey and other common honeys
5-羟甲基糠醛含量是一项反映蜂蜜新鲜度的重要指标。新鲜蜂蜜中羟甲基糠醛的含量一般较低，而一旦经过加热或长期贮存，蜂蜜中的还原性糖与部分氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，致使5-羟甲基糠醛含量升高[16]，严重影响蜂蜜色泽和口感。GH/T 18796中规定羟甲基糠醛含量<40 mg/kg。由表2可知，绝大多数紫穗槐蜂蜜中羟甲基糠醛含量较低，最高为3.5 mg/kg，部分未检出，说明其新鲜度较高。No.1样品羟甲基糠醛含量较高，达到为28.7 mg/kg，尽管其含量低于40 mg/kg，符合标准要求，但其含量远高于其它样品，说明该样品新鲜度较差，推测其原因是由于此样品采集时间较早，采集后没有及时送至实验室进行冷藏或冷冻保存，导致其新鲜度变差。
还原糖含量是评价蜂蜜质量优劣的主要参数[14]，主要包含葡萄糖和果糖。GH/T 18796和食品安全国家标准GB 14963—2011《蜂蜜》均规定果糖和葡萄糖的总含量≥60%。由表2可得，紫穗槐蜂蜜中果糖的含量为38.7%～43.1%，平均值为40.4%，葡萄糖的含量为26.1%～30.1%，平均值为28.3%，葡萄糖和果糖的总含量为65.9%～71.1%，平均值为68.7%，符合国家标准规定。大宗蜜源蜂蜜如荆条蜜[4]、枣花蜜和洋槐蜜[17]中还原糖的含量分别为69.4%、62.9%、62.0%，小蜜种蜂蜜如野桂花蜜[18]和茴香蜜[19]的还原糖分别为61.9%和61.0%。对比结果表明，紫穗槐蜂蜜还原糖含量相比枣花蜜、洋槐蜜、野桂花和茴香蜜均较高，与荆条蜜中还原糖含量相当。
果葡比(果糖/葡萄糖，F/G)是预测蜂蜜结晶性的重要参数。已有研究发现当F/G>1.33时，则蜂蜜长时间不易结晶，当F/G<1.11时，则蜂蜜极易结晶[20]。紫穗槐蜂蜜的F/G范围为1.33～1.55，高于油菜蜜0.95[21]、枣花蜜1.20[17]和荆条蜜1.31[17]，与洋槐蜜数值1.43[22]相当，说明紫穗槐蜂蜜不易形成结晶，与实际情况一致。
蜂蜜在酿造过程中，蔗糖在消化酶的作用下转化为还原糖，因而一般成熟蜂蜜中的蔗糖含量较低[3]。GB 14963—2011中规定一般蜂蜜中蔗糖含量不高于5%。由表2可知，紫穗槐蜂蜜中蔗糖含量均小于2.42%，平均值为0.96%，均符合标准要求。
2.2 挥发性成分测定结果与分析
蜂蜜中挥发性成分的种类和数量是衡量蜂蜜品质的重要指标之一。利用HS-SPME-GC-MS技术测定紫穗槐蜜挥发性成分，代表性样品总离子流色谱图如图2所示。紫穗槐蜂蜜中共检测出78种，其中醇类14种，芳香类6种，醛类16种，酸类11种，萜烯类3种，酮类13种，烷烃类8种，酯类4种等，详见电子增强出版附表(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028912)。
1-甲苯；2-庚醛；3-苯甲醛；4-苯乙醛；5-顺式芳樟醇氧化物；6-芳樟醇；7-壬醛；8-苯乙醇；9-苯基腈；10-癸醛
图2 紫穗槐蜜挥发性成分总离子流图
Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in A.fruticosa honey
紫穗槐蜂蜜的挥发性成分种类和数量对比见图3，表明其挥发性成分数量较多的为醛类、醇类和酮类，含量最高的为醛类(38.30%)，醇类(31.70%)和萜烯类(7.54%)物质，其总含量达到77.54%。该结果与JERKOVI等[10]报道的醇类是紫穗槐蜂蜜主要挥发性物质的结论一致。
图3 紫穗槐蜂蜜中不同类型挥发性成分的数量和相对含量
Fig.3 Quantities and relative amounts of different kinds of volatile components in A.fruticosa honey
对紫穗槐蜂蜜中单体挥发性成分进行分析，发现其含量较高的物质分别为苯乙醇(19.46%)、苯乙醛(14.03%)、苯甲醛(2.56%)和2,4-二叔丁基苯酚(2.56%)等。苯乙醛为枣花蜜主要挥发性成分[23]，在枣花蜜[23]、荔枝蜜[24]、荞麦蜜[11]等蜂蜜中均有存在，但含量较低，说明苯乙醇可能是紫穗槐蜂蜜特征性的挥发性成分，有望作为紫穗槐蜂蜜鉴别的特征标识化合物。
壬醛在本研究的大部分紫穗槐样品中均有检出，且含量较高(平均含量13.54%)，是紫穗槐蜂蜜中主要的醛类物质之一。已有研究在枣花蜜中检测出较高含量的壬醛[23,25]，椴树蜜、荆条蜜、洋槐蜜和苕子蜜等蜂蜜样品中也有少量检出[25]，对比结果表明壬醛是我国蜂蜜中一种常见挥发性成分。
芳樟醇及其衍生物是紫穗槐蜜中另一类重要化合物，主要包含顺式芳樟醇氧化物(4.09%)、反式芳樟醇氧化物(1.79%)、芳樟醇(1.81%)、氧化芳樟醇(0.71%)、反式芳樟醇3,7-氧化物(0.62%)、丁香醛(0.58%)等。芳樟醇及其衍生物在大宗蜜种如枣花蜜[23]、荆条蜜[25]、油菜蜜[26]、洋槐蜜中均有检出，顺式芳樟醇氧化物是洋槐蜜中主要挥发性成分[9]。小蜜种如荔枝蜜[24]、栗子蜜[26]、柑橘蜜[27]也均有检出，且芳樟醇衍生物为西班牙柑橘蜜的特征挥发性成分[27]。结果表明，芳樟醇及其衍生物是包括紫穗槐蜜在内的蜂蜜中一类常见的挥发性物质。
此外，紫穗槐蜂蜜中还含有少量的酸类挥发性物质，主要包括乙酸(1.87%)、异辛酸(1.28%)、壬酸(1.21%)等。
3 结论
采用现有标准方法对8批紫穗槐蜜的理化指标(水分、酸度、淀粉酶值、羟甲基糠醛、还原糖、蔗糖)进行测定。结果表明，其水分含量范围为15.5%～17.8%，酸度范围为14.8～25.8 mL/kg，淀粉酶值的范围为27.2～70.6 mL/(g·h)，5-羟甲基糠醛含量不超过28.7 mg/kg，还原糖含量为65.9%～71.1%，蔗糖含量不超过2.42%，各项指标均符合国家和行业标准要求。采用HS-SPME-GC-MS技术对紫穗槐蜜的挥发性成分进行检测，共检出挥发性物质78种，主要包括醛类、醇类、酸类、萜烯类、芳香类等物质。含量较高的物质为苯乙醇、苯乙醛、壬醛，其中，与文献比对结果表明，苯乙醇是紫穗槐蜂蜜的特征挥发性成分。综合全文结果表明，紫穗槐蜂蜜具有酶值高、挥发性成分丰富的特点。
本研究对中国特色紫穗槐蜂蜜的理化指标和挥发性成分进行了系统分析和评价，为紫穗槐蜂蜜的品质评价和开发推广提供了一定的技术和数据支撑。
[1] 祝敏, 靳林, 赵浩安, 等.紫穗槐蜂蜜对小鼠急性酒精性胃溃疡的预防作用[J].食品科学, 2021, 42(9):77-84.
ZHU M, JIN L, ZHAO H A, et al.Gastroprotective effect of Amorpha fruticosa L.honey against ethanol-induced acute gastric ulcer in mice[J].Food Science, 2021, 42(9):77-84.
[2] 周娟. 枣花蜜理化指标及抗氧化活性研究[D].西安:西北大学, 2013.
ZHOU J.Physicochemical characterization and antioxidant activity of jujube honey[D].Xi’an:Northwest University, 2013.
[3] 韩苗苗, 张先, 郑永勋, 等.延边地区椴树蜜品质特性研究[J].中国蜂业, 2012, 63(S2):76-80.
HAN M M, ZHANG X, ZHENG Y X, et al.Quality characteristics of linden honey from different regions of YanJi[J].Apiculture of China, 2012, 63(S2):76-80.
[4] 王远. 荆条蜜的理化性质及其抗氧化活性研究[D].西安:西北大学, 2015.
WANG Y.Physicochemical characterization and antioxidant activity of vitex honey[D].Xi’an:Northwest University, 2015.
[5] CR
CIUN M E, P
RVULESCU O C, DONISE A C, et al.Characterization and classification of Romanian Acacia honey based on its physicochemical parameters and chemometrics[J].Scientific Reports, 2020, 10(1):20690.
[6] 岳锦萍, 高寒, 王丹丹, 等.利用理化参数鉴别掺假蜂蜜[J].食品科学技术学报, 2018, 36(3):48-55.
YUE J P, GAO H, WANG D D, et al.Identification of adulterated honey based on physical and chemical parameters[J].Journal of Food Science and Technology, 2018, 36(3):48-55.
[7] PENTO
K, 
UCZYCKA D, OSZMIA
SKI J, et al.Polish honey as a source of antioxidants：A comparison with Manuka honey[J].Journal of Apicultural Research, 2020, 59(5):939-945.
[8] GERHARDT N, BIRKENMEIER M, SCHWOLOW S, et al.Volatile-compound fingerprinting by headspace-gas-chromatography ion-mobility spectrometry (HS-GC-IMS) as a benchtop alternative to 1H NMR profiling for assessment of the authenticity of honey[J].Analytical Chemistry, 2018, 90(3):1 777-1 785.
[9] CHEN H, JIN L H, FAN C L, et al.Non-targeted volatile profiles for the classification of the botanical origin of Chinese honey by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry combined with chemometrics[J].Journal of Separation Science, 2017, 40(22):4 377-4 384.
[10] JERKOVI I, MARIJANOVI Z, KEZI J, et al.Headspace, volatile and semi-volatile organic compounds diversity and radical scavenging activity of ultrasonic solvent extracts from Amorpha fruticosa honey samples[J].Molecules (Basel, Switzerland), 2009, 14(8):2 717-2 728.
[11] 王桃红, 张少博, 张会敏, 等.荞麦蜜中挥发性成分测定及其与成熟度的相关性分析[J].食品科学, 2020, 41(22):222-230.
WANG T H, ZHANG S B, ZHANG H M, et al.Determination of volatile components in buckwheat honey and correlation analysis with honey maturity[J].Food Science, 2020, 41(22):222-230.
[12] 汪思凡, 曹振辉, 潘洪彬, 等.蜂蜜化学成分及其主要生物学功能研究进展[J].食品研究与开发, 2018, 39(1):176-181.
WANG S F, CAO Z H, PAN H B, et al.Research progress on chemical composition and major biological function of honey[J].Food Research and Development, 2018, 39(1):176-181.
[13] NASCIMENTO K S, SATTLER J A G, MACEDO L F L, et al.Phenolic compounds, antioxidant capacity and physicochemical properties of Brazilian Apis mellifera honeys[J].LWT, 2018, 91:85-94.
[14] BONTA V, DEZMIREAN D S, MRGHITA
L A, et al.Sugar spectrum, hydroxymethylfurfural and diastase activity in honey:A validated approach as indicator of possible adulteration[J].Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca Animal Science and Biotechnologies, 2020, 77(2):44.
[15] 叶梦迪. 油菜蜂蜜成熟过程中蛋白质和糖分变化的研究[D].杭州:浙江工商大学, 2015.
YE M D.Research on the change of protein and carbohydrate of rape honey in ripening process[D].Hangzhou:Zhejiang Gongshang University, 2015.
[16] 高慧丰. 炼蜜炮制机理研究：美拉德反应对炼蜜炮制及其生物活性的影响[D].济南:山东大学, 2015.
GAO H F.Processing mechanism of refined honey:Effect of Maillard reaction on its processing and biological activities[D].Jinan:Shandong University, 2015.
[17] 鞠锋清. 三种蜂蜜差异性探究与鉴别[D].泰安:山东农业大学, 2019.
JU F Q.Exploration and identification of the differences of three honeys[D].Tai’an:Shandong Agricultural University, 2019.
[18] 张丽珍, 曾志将, 郑云林, 等.江西野桂花蜂蜜成分分析[J].食品科学, 2012, 33(10):195-199.
ZHANG L Z, ZENG Z J, ZHENG Y L, et al.Composition analysis of honey from Cinnamomum obtusifolium (Roxb.) flowers grown in Jiangxi[J].Food Science, 2012, 33(10):195-199.
[19] ZHANG Y Z, SI J J, LI S S, et al.Chemical analyses and antimicrobial activity of nine kinds of unifloral Chinese honeys compared to Manuka honey (12+ and 20+)[J].Molecules, 2021, 26(9):2778.
[20] WHITE J W.Honey[J].Advances in Food Research, 1978, 24(3):287-374.
[21] SMANALIEVA J, SENGE B.Analytical and rheological investigations into selected unifloral German honey[J].European Food Research & Technology, 2009, 229(1):107-113.
[22] 马天琛. 成熟洋槐蜜的鉴别方法及其生物活性研究[D].西安:西北大学, 2020.
MA T C.Studies on the identification method and biological activity of mature Acacia honey[D].Xi’an:Northwest University, 2020.
[23] 敖常伟, 吕姗, 吴香菊, 等.枣花及枣花蜜香气成分分析[J].食品科学, 2018, 39(20):182-189.
AO C W, LYU S, WU X J, et al.Analysis of aroma components from jujube flowers and honey[J].Food Science, 2018, 39(20):182-189.
[24] 王华堂, 黄文忠, 朱颖茵, 等.荔枝蜜中挥发性成分的指纹图谱研究[J].环境昆虫学报, 2018, 40(6):1 437-1 444.
WANG H T, HUANG W Z, ZHU Y Y, et al.Study on the chromatographic fingerprint of volatile components from litchi honey[J].Journal of Environmental Entomology, 2018, 40(6):1 437-1 444.
[25] 魏泉增, 臧蓓蕾, 肖付刚.不同蜜源蜂蜜挥发性成分差异分析[J].食品研究与开发, 2020, 41(15):143-149.
WEI Q Z, ZANG B L, XIAO F G.Analysis of volatile components of honey from different honey sources[J].Food Research and Development, 2020, 41(15):143-149.
[26] 
P
NIK I, PAŽITN A, IKA P, et al.The determination of botanical origin of honeys based on enantiomer distribution of chiral volatile organic compounds[J].Food Chemistry, 2014, 158:497-503.
[27] CASTRO-VZQUEZ L, D
AZ-MAROTO M C, GONZLEZ-VI
AS M A, et al.Differentiation of monofloral citrus, rosemary, eucalyptus, lavender, thyme and heather honeys based on volatile composition and sensory descriptive analysis[J].Food Chemistry, 2009, 112(4):1 022-1 030.