据世界卫生组织报道，每年因食用受污染的食品而发生疾病的人数超过6亿，这其中大多数是由食品中的致病菌引起[1]。我国2008—2015年的食品中毒调查结果显示，62.0%的中毒事件是由致病菌引起的[2]，常见的食源性致病菌有沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等。因此食品中致病菌的控制是食品安全研究关注的重要内容[3]。
抗菌抑制剂是一类可以杀灭或者抑制细菌生长的物质，既可以天然存在也可以人工合成。随着消费者对较低限度加工和不含化学添加剂食品需求的增强，天然抗菌抑制剂因其无毒或低毒以及良好的抑菌效果而受到青睐[4]。ɛ-聚赖氨酸(ɛ-polylysine，ɛ-PL)最早是由日本学者从白色链霉培养基中发现并分离[5]，现在常通过发酵法、化学合成等方法进行工业生产。ɛ-PL通过α-羧基和ɛ-氨基之间的酰胺键连接、25～30个赖氨酸单体组成的多肽，现已公认至少需要10个赖氨酸残基才可发挥抑菌作用，抑菌效果与赖氨酸残基的数量成正比[6-7]。ɛ-PL具有良好的热稳定性、水溶性、可食用性和生物降解性，是一种抑菌谱广、稳定性高和安全性强且应用广泛的抑菌剂[8-9]。
20世纪80年代ɛ-PL在日本即被用作商用抑菌剂在牛肉、软饮料、奶酪、沙拉调料、鱼和土豆类等食品中广泛应用；2004年美国食品药品监督管理局将ɛ-PL认为是一种安全的食品添加剂(GRAS编号：000135)；2014年我国也将ɛ-PL批准作为食品添加剂(GB 2760—2014)并对其作出了限量要求，焙烤食品中限量为0.15 g/kg，熟肉食品中限量为0.25 g/kg，果蔬汁类及其饮料中限量为0.2 g/L，同时也允许其在水产品、生鲜畜肉、乳及乳制品等其他种类食品中添加。
本文围绕ɛ-PL对不同食源性致病菌的抑菌效果，重点围绕ɛ-PL在实验室培养基和食品基质中单独和联合使用对致病菌控制效果，并阐述了ɛ-PL对致病菌的抑菌机理，以期为ɛ-PL在食品中合理高效的应用提供参考。
1 ɛ-PL对重要的食源性致病菌控制效果
1.1 培养基中ɛ-PL对致病菌的控制效果
ɛ-PL对单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌等重要食源性致病菌都具有良好的抑菌效果[10]，其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concerntration,MIC)大多低于100 μg/mL[11]。如表1所示，ɛ-PL对致病菌的抑菌效果可通过细菌吸光度改变、抑菌圈大小、抑制菌落数目、存活率等方法和指标判断。
表1 培养基中ɛ-PL对不同种致病菌的控制效果
Table 1 Effect of ɛ-PL on the pathogens in culture medium
食源性致病菌菌株ρ(ɛ-PL)/(μg·mL-1)实验培养基抑菌效果参考文献革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌鼠伤寒沙门氏菌自分离菌株O157:H7自分离菌株ATCC 87393株混合菌株自分离菌株DH 5aTUST 0063株混合菌株12.5BEP吸光度48 h降低0.516TSB吸光度 24 h降低1.550BEP抑菌活性2 h为0.9 U100BEP抑菌圈为(9.0±0.4) mm200BEP抑菌圈为(10.0±0.5) mm100TSB-YE48 h减少2.7 lg CFU/mL100NB抑菌率(73.0±1.4)%;100LB4 h后存活率为0.2%150LB4 h后存活率为5.6%100TSB-YE48 h减少1.9 lg CFU/mL[14][15][16][12][7][17][18][19][7]革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌单增李斯特菌自分离菌株ATCC 65383株混合菌株3株混合菌株ATCC 1911512.5BEP吸光度48 h降低0.4100BEP抑菌圈为(10.0±0.2) mm50BHI5 d减少6.0 lg CFU/mL100TSB-YE48 h减少2.6 lg CFU/mL100PEG4 h减少5.0 lg CFU/mL200PEG4 h减少6.0 lg CFU/mL[14][12][20][7][13]
注：BEP-牛肉膏蛋白胨培养基；TSB-胰蛋白胨大豆肉汤培养基；NB-营养肉汤培养基；LB-肉膏蛋白胨培养基；BHI-脑心浸液肉汤培养基；PEG-酵母提取物葡萄糖培养基；TSB-YE-含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉汤
在培养基中，ɛ-PL对重要食源性致病菌的控制效果因选用菌株和实验条件不同而异。研究中ɛ-PL工作浓度通常低于100 μg/mL，在此浓度下ɛ-PL对重要食源性致病菌等都具有良好的抑菌效果。CHANG等[7]使用100 μg/mL ɛ-PL对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌分别进行抑菌效果研究，结果发现48 h后其菌落数分别减少2.7、1.9和2.6 lg CFU/mL。ɛ-PL的抑菌效果随着其浓度的增加而增大，LI等[12]使用100 μg/mL ɛ-PL对大肠埃希氏菌进行抑菌实验可获得9.0 mm的抑菌圈，而使用200 μg/mL ɛ-PL抑菌圈扩大为10.0 mm。LIN等[13]对单增李斯特菌的研究也取得类似效果，100 μg/mL ɛ-PL处理4 h后，单增李斯特菌减少5.0 lg CFU/mL，而200 μg/mL处理减少6.0 lg CFU/mL。
通常情况下，革兰氏阴性菌对ɛ-PL的敏感性要高于革兰氏阳性菌，这可能与细胞壁成分有关，革兰氏阴性菌细胞壁表面的脂多糖层带有大量负电荷，革兰氏阳性菌细胞壁表面稀疏的磷壁酸带有少量负电荷，因此革兰氏阴性菌比阳性菌更容易吸附ɛ-PL[18]。研究发现，在相同条件下ɛ-PL对大肠埃希氏菌的控制效果优于金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌[7,14]。然而也有观点认为ɛ-PL的抑菌效果可能不取决于细菌种类，而取决于细菌细胞的体积，细胞体积越大，细胞膜的比表面积越小，ɛ-PL与细胞膜表面负电荷吸附数量比越低，从而敏感性越小[21]。MUTO[22]比较了大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、酿酒酵母等9种不同大小细胞对ɛ-PL的敏感性，得出细胞体积与其对ɛ-PL敏感性负相关。
1.2 食品基质中ɛ-PL对致病菌的控制效果
ɛ-PL在不同的食品基质中对致病性大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌等重要致病菌都具有较好的抑菌效果(表2)。GEORNARAS等[23]分别研究了200 μg/mL ɛ-PL在脱脂牛奶、全脂牛奶、牛肉、腊肠、米饭、蔬菜中对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌的作用效果。结果发现，6 d后致病菌减少了3.5～5.0 lg CFU/mL(g)，在不同食品中的作用效果稍有差异。在食品基质中ɛ-PL使用浓度越大，其对致病菌的抑制效果越好。李唐飞等[24]用50 μg/mL ɛ-PL在鱼糜中可以保持12 d菌落总数保持不变，而100 μg/mL浓度下菌落总数下降了0.5 lg CFU/g。此外，在食品基质中添加ɛ-PL，可以使致病菌菌落数长时间不再增涨。LI等[25]研究发现200 μg/mL ɛ-PL在牛肉中可以保持12 d菌落数保持不变。该结果与孙链等[26]研究结果一致，他们将250 μg/mL ɛ-PL应用于冷冻牛后腿肉中，可以保持55 d菌落数保持不变。
表2 食品基质中ɛ-PL对不同种致病菌的控制效果
Table 2 Effects of ɛ-PL on foodborne pathogens in food matrix
食源性致病菌菌株ρ(ɛ-PL)/(μg·mL-1)食品基质抑菌效果参考文献革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌鼠伤寒沙门氏菌3株O157:H7混合菌株3株混合菌株3株混合菌株20010040100脱脂牛奶6 d降低3.7 lg CFU/mL全脂牛奶6 d降低3.8 lg CFU/mL牛肉6 d降低3.7 lg CFU/g腊肠6 d降低3.5 lg CFU/g米饭6 d降低3.6 lg CFU/g蔬菜6 d降低3.9 lg CFU/g烤牛肉7 d降低1.9 lg CFU/g脱脂牛奶6 d降低4.0 lg CFU/mL全脂牛奶6 d降低3.8 lg CFU/mL牛肉6 d降低3.9 lg CFU/g腊肠6 d降低4.4 lg CFU/g米饭6 d降低4.2 lg CFU/g蔬菜6 d降低3.9 lg CFU/g烤牛肉7 d降低0.7 lg CFU/g[23][7][23][7]革兰氏阳性菌单增李斯特菌10株混合菌株2003株混合菌株100脱脂牛奶6 d降低5.0 lg CFU/mL全脂牛奶6 d降低5.0 lg CFU/mL牛肉6 d降低4.6 lg CFU/g腊肠6 d降低3.7 lg CFU/g米饭6 d降低4.6 lg CFU/g蔬菜6 d降低4.5 lg CFU/g烤牛肉7 d降低0.6 lg CFU/g[23][7]菌落总数50鱼糜12 d菌落总数几乎不变[24]菌落总数200牛肉块12 d菌落总数几乎不变[25]菌落总数250冷冻牛后腿肉55 d菌落总数几乎不变[26]
相同工作浓度下，ɛ-PL在食品基质中的抑菌弱于培养基中的效果。对同一株大肠埃希氏菌研究发现，在TSB-YE培养基中48 h细菌数降低了2.7 lg CFU/mL，而在烤牛肉中7 d仅降低了1.9 lg CFU/g。单增李斯特菌在TSB-YE培养基中48 h降低了2.6 lg CFU/mL，而在烤牛肉中7 d仅降低了0.6 lg CFU/g。同样地，鼠伤寒沙门氏菌在TSB-YE培养基中48 h降低了1.9 lg CFU/mL，而在烤牛肉中7 d仅降低了0.7 lg CFU/g[7]。
在食品基质中，ɛ-PL可能会与食品中某些食品大分子相互作用、被蛋白酶水解导致ɛ-PL的抑菌效果降低。AASEN等[27]发现在生鸡肉和鱼中乳酸链球菌素(Nisin)可以快速吸附在食品的蛋白质中，随着蛋白质水解，导致其抑菌活性逐渐丧失。因此，相比于在培养基中的理想环境，ɛ-PL在食品基质中抑菌效果有所降低。
2 ɛ-PL与其他抑菌剂联合使用对重要的致病菌抑制效果
尽管单独使用ɛ-PL对重要食源性致病菌具有良好的抑菌效果，但是通过ɛ-PL与其他抑菌剂联合使用形成协同抑菌效应，可以增强对致病菌的抑制效果，维持ɛ-PL对致病菌的抑制稳定期，还可以在取得较好抑制效果前提下减少ɛ-PL使用剂量。协同抑菌效应是指多个抑菌物质联合应用的效果高于各抑菌物质单独使用时的作用效果[28]。通过协同抑菌效应能够有效提高抑菌剂抑菌活性，降低抑菌剂使用量，提高食品安全性等[29-30]。
研究中常将ɛ-PL与抗菌肽、精油、氨基酸等抑菌剂联合使用(表3)。ɛ-PL与抗菌肽联合使用可以增强对致病菌的抑制效果。宁亚维等[31]研究发现，单独使用3.9 μg/mL ɛ-PL、2.5 AU/mL抗菌肽brevilaterin时在24 h后菌落总数分别为8.0和7.0 lg CFU/mL，而在同浓度下将两者联合使用时24 h时菌落总数为5.0 lg CFU/mL。LIU等[32]通过分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC)指数大小来判断2种抑菌剂联合使用是否产生协同抑菌效应，FIC<0.5则说明2种抑菌剂具有协同效应，并且FIC值越小则表明协同效果越高。ɛ-PL与Nisin联合使用FIC为0.3，表明ɛ-PL与Nisin对金黄色葡萄球菌具有协同抑菌效应[33]。ɛ-PL与精油、氨基酸联合使用也可以产生协同抑菌效应，ɛ-PL与迷迭香、八角茴香精油、牛至精油联合使用对致病菌的菌落总数比单独使用都低约1.0 lg CFU/g。ɛ-PL与香芹酚精油对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌联合使用FIC值分别为0.5和0.4。ɛ-PL和甘氨酸在牛奶和猪后腿肉中联合使用，与对照组相比都明显减少了其菌落数。
表3 ɛ-PL与其他抑菌剂对不同食源性致病菌的控制效果
Table 3 Combination effects of ɛ-PL and other bacteriostatic agents on different foodborne pathogens
菌种基质ɛ-PL其他抑菌剂单独使用抑菌效果联合使用抑菌效果参考文献抗菌肽金黄色葡萄球菌ATCC 25923培养基3.9 μg/mL抗菌肽brevilat-erin 2.5 AU/mL24 h时菌落总数8.0 lg CFU/mL24 h时菌落总数5.0 lg CFU/mL[31]单增李斯特菌Scott ATSB培养基5 μg/mLNisin150 IU/mL24 h OD630≈0.224 h OD630≈0.0[10]金黄色葡萄球菌ATCC 25923牛肉膏蛋白胨培养基31.2 μg/mLNisin250.0 μg/mL/FIC≈0.3[32]精油菌落总数鸡胸肉5 g/mL迷迭香2 g/mL10 d时菌落总数6.0 lg CFU/g10 d时菌落总数5.0 lg CFU/g菌落总数TSB培养基75 μg/mL牛至精油1.2 mg/mL6 d时菌落总数7.0 lg CFU/g6 d时菌落总数6.0 lg CFU/g菌落总数肴肉670 μg/mL八角茴香精油6 mg/mL20 d时菌落总数5.7 lg CFU/g20 d时菌落总数4.8 lg CFU/g金黄色葡萄球菌CICC 21600LB培养基6.25 μg/mL香芹酚精油80 μg/mL/FIC=0.5大肠埃希氏菌CICC 10664LB培养基6.25 μg/mL香芹酚精油80 μg/mL/FIC≈0.4[34][35][36][37]氨基酸菌落总数牛奶420 μg/mL甘氨酸20mg/mL/11 d时菌落总数5.6 lg CFU/mL[38]菌落总数猪后腿肉400 μg/mL甘氨酸20 μg/mL24 d时菌落总数7.0 lg CFU/g24 d时菌落总数6.0 lg CFU/g[14]
在单独使用ɛ-PL取得相同抑制效果情况下，ɛ-PL与其他抑菌剂联合使用，可以减少ɛ-PL使用剂量，同时还可以维持对致病菌的抑制时间。ɛ-PL的抑菌作用随着时间的延长而增加，在抑制初期，ɛ-PL抑菌效果较低，无法很快地对致病菌进行抑制作用，而Nisin对致病菌的抑制作用是随着时间的延长而降低。LIU等[32]通过ɛ-PL和Nisin对枯草芽孢杆菌进行抑制发现，在24 h内1 MIC的ɛ-PL抗菌活性从0.4 U逐渐升至0.8 U，而1 MIC的Nisin抗菌活性从0.8 U逐渐降至0.4 U，但是两者联合使用可以在1/4 MIC下将抗菌活性稳定在0.8 U左右。LIU等[39]通过1 MIC的ɛ-PL和Nisin对粪肠球菌联合作用发现，单独使用ɛ-PL或Nisin的抑菌效果与1/8 MIC的ɛ-PL和Nisin联合使用在22 h抑菌效果相同，菌落总数为5.5 lg CFU/g。因此，通过ɛ-PL和Nisin联合作用，可以更好的对致病菌进行抑制。
3 ɛ-PL的抑菌机理
由于细菌的外膜通常带有一定的负电荷，而ɛ-PL是一种带正电荷的抗菌肽[40]，其可以通过静电作用与细菌的细胞壁相结合。ɛ-PL破坏细胞壁后，进而与细胞膜表面负电荷结合，使得细胞膜裂解，引起细胞内的物质、能量和信息传递中断，最终导致细胞死亡[41]。这种作用机制使得细菌难以产生耐药性，从而显著提高了抑菌效率。ɛ-PL主要作用于细菌细胞壁和细胞膜，同时对细胞内的蛋白质、DNA、ATP等也有影响作用，围绕细胞成分或结构可通过多种方法进行抑菌机理的研究(表4)。
表4 ɛ-PL作用对细胞的影响及检测方法
Table 4 Effect of ɛ-PL on cell and its detection method
细胞成分或结构检测方法参考文献细胞壁测520 nm波长处碱性磷酸酶的吸光度值,吸光度越高,细胞壁破坏越严重[42]荧光分光光度计分别在420 nm下检测荧光强度,荧光强度越高,细胞壁破坏越严重[19]细胞膜测细胞相对电导率,电导率越高,细胞膜破坏越严重[12]扫描电镜观察,细胞越粗糙皱缩、无饱满感、细胞间聚团黏连明显,细胞膜破坏越严重[39]测420 nm波长处β-半乳糖苷酶的吸光度值,吸光度越高,细胞内膜破坏越严重[15]蛋白质SDS-PAGE,染色越浅,细胞蛋白含量减少严重[12]测280 nm波长处蛋白质吸光度值,吸光度越高,蛋白质渗漏越严重[19]DNA测260 nm波长处DNA吸光度值,吸光度越高,DNA渗漏越严重[19]ATP测荧光素酶转化成荧光素产生的光值,光值越低,ATP酶活性抑制越严重[13]
3.1 ɛ-PL对细菌细胞壁的影响
根据革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁表面带负电荷数量的不同，ɛ-PL对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌机制模型可分成桶板模型和毡毯模型[18,43]，如图1所示。
图1 ɛ-聚赖氨酸抑菌机制模型
Fig.1 Bacteriostatic mechanism model of ɛ-PL
革兰氏阳性菌细胞壁主要成分是肽聚糖，带负电荷的磷壁酸分散排布在肽聚糖层中，这使得革兰氏阳性菌细胞壁表面所携带的负电荷分布较为分散。ɛ-PL通过静电吸附在磷壁酸后，形成中间空洞，随后ɛ-PL通过疏水区域接触细胞膜并发生作用，亲水区域则组成可以跨膜的离子通道，整个结构如桶板状形成离子通道，使得ɛ-PL通过细胞壁接触细胞膜。
革兰氏阴性菌细胞壁外膜主要成分是脂多糖层，带负电荷的脂多糖层可使ɛ-PL大面积地覆盖在细胞壁表面，形如毯状对细菌表面结合。ɛ-PL是以扩散的方式破坏其完整性，没有在细胞膜上形成离子通道。当ɛ-PL的浓度达到一定程度后，细胞膜上会出现瞬时的孔洞，可使得ɛ-PL通过细胞壁接触细胞膜。
细胞壁与细胞膜之间存在一种碱性磷酸酶(alkaline phosphate,AKP)，这种酶被细胞壁包被在内不能在细菌外部测出其活性。当ɛ-PL破坏细菌细胞壁后，该碱性磷酸酶会从细胞壁破裂处渗透出来，可以通过测量该酶的活性变化来判断细胞壁破损程度[42]。蓝蔚青等[44]通过检测腐生葡萄球菌AKP的活力，对照组AKP活力为1.4 U/L，ɛ-PL作用后AKP活力为2.2 U/L，结果表明该腐生葡萄球菌细胞壁被ɛ-PL所破坏。
3.2 ɛ-PL对细菌细胞膜的影响
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞膜成分的完整性是细菌存活的关键决定因素，也是细菌细胞内完成的各种重要生理活动的主要因素[45]。
ɛ-PL通过静电作用吸附在细菌细胞膜表面，可以破坏细胞膜结构，引起细胞膜裂解，此时细胞膜流动性降低，细胞内外渗透压失衡，使得细胞内K+、Na+等阳离子大量外泄，造成细胞培养液电导率升高[46]，这些物质的外泄，可以作为细胞膜破损的标注。LIN等[13]对ɛ-PL处理后的单增李斯特菌培养液电导率进行测量发现，2 MIC组电导率在5 h时由0.2 mS/cm上升到0.3 mS/cm，其细菌表面ζ电位在5 h时由-32 mV上升到-10 mV。LI等[12]对ɛ-PL处理后的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌培养液电导率进行测量，发现与对照组相比，3 h后处理组的电导率增加了92%。随着时间的推移，其电荷流动速度也会逐渐减慢，表明细胞膜被完全破坏。
4 总结
ɛ-PL作为一种优良的生物抑菌剂，因其稳定性、安全性和良好的抑菌能力，现在已被中国、美国和日本等国家批准为食品添加剂，并广泛应用于肉制品、乳制品、果蔬制品及水产品等。在食品中添加ɛ-PL不仅可以有效抑制食品中致病菌的生长并延长食品货架期，而且不影响食品风味。同时，ɛ-PL可以与其他抑菌剂联合使用，以增强ɛ-PL的抑菌能力，提高食品的安全性。
在ɛ-PL研究和应用领域的工作，可以从以下方面进一步开展：ɛ-PL对细菌的抑制作用机制研究并不完善，ɛ-PL是否会改变细胞内DNA、蛋白质等结构，进而影响细胞生长，在更深层次对细胞进行抑制仍需研究；ɛ-PL处理对细菌细胞环境抗性、毒力等其他生物学特征产生的影响；ɛ-PL与其他抑菌剂联合处理研究较多，未来可通过栅栏技术将ɛ-PL与其他新型致病菌控制方式结合进行研究。
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