基于非靶向代谢组学分析酱香型大曲中抑菌黑曲的功能成分

罗帅1,2,3,张巧玲4,杨帆4,卢建军4,蒲秀鑫4,张娟1,3*,王莉4*

1(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡,214122)2(江南大学,未来食品科学中心,江苏 无锡,214122)3(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214122)4(贵州茅台股份有限公司,贵州 遵义,564501)

摘 要 酱香型大曲是白酒酿造的关键环节,为白酒酿造提供丰富的酶和风味物质前体。然而,过度繁殖的乳酸菌将引起大曲酸度升高并降低糖化力、发酵力和出酒率。抑菌黑曲(antibacterial black Daqu,BBQ)是一种能够抑制乳酸菌的特殊黑曲。因此,解析抑菌黑曲中抑制乳酸菌的关键代谢物将有助于降低大曲酸度。这项研究利用非靶向代谢组学分析了抑菌黑曲和黑曲的代谢物,发现抑菌黑曲中有259种显著上调的差异代谢物。香兰素、萘啶酸、2-甲基呋喃和黑色素被鉴定为潜在的抑菌物质,并通过体外纯培养乳酸菌得到了证实。抑菌黑曲中的酪氨酸代谢显著上调,该代谢通路终产物是黑色素。香兰素由苯丙氨酸代谢产生。抑菌黑曲中频繁的美拉德反应生成大量有机杂环类物质包括2-甲基呋喃和萘啶酸。综上所述,黑曲中香兰素、萘啶酸、2-甲基呋喃和黑色素的积累,使其产生抑制乳酸菌活性。该研究将有助于通过提升大曲品质来降低酱香型白酒的酸度。

关键词 酱香型大曲;抑菌黑曲;香兰素;萘啶酸;2-甲基呋喃;黑色素;乳酸菌

白酒按照风味特征可分为酱香型白酒、浓香型白酒和清香型白酒。酱香型白酒酒体醇厚、回味悠长、空杯持久留香,深受消费者的喜爱[1]。酱香型白酒酿造历史悠久,生产工艺独特,包括高温制曲、高温堆积、高温发酵和高温馏酒。其中,高温制曲是一个十分重要的环节,大曲为酿造过程中的糖化、发酵、香气产生提供酶和风味物质前体,高温度高湿度的大曲发酵条件造就了大曲独特的微生物群落结构和丰富的酶体系[2]。但是,由于发酵仓的不同部位温湿度差异导致了大曲菌群及代谢成分的差异。因此,一批大曲发酵完成拆仓后,大曲一般按感官评估分为三类,命名为白曲、黄曲和黑曲(black Daqu,BQ)[3]

降酸问题一直是酱香型白酒酿造的核心问题之一。酱香型大曲发酵较高的温度使细菌利用小麦中的蛋白质和糖,产生大量的有机酸和氨基酸,使大曲的酸度升高,酸度过高不仅导致大曲糖化力降低,发酵力减弱。而且还会使杂菌生长繁殖,对生产设备产生腐蚀性,加快窖泥老化,最终导致出酒率降低,增加生产成本[4-6]。我们前期偶然发现,有些黑曲能够抑制乳酸菌的生长,并对100多份样品进行了抑菌性试验,从中获得了2份能够抑制乳酸菌的黑曲,称为抑菌黑曲(antibacterial black Daqu,BBQ)。其特征较之普通黑曲颜色更黑,风味更加浓郁。

近年来,代谢组学方法已广泛应用于大曲代谢物的研究[7-8]。因此,我们基于代谢组学方法研究了黑曲和抑菌黑曲的代谢物,分析了抑菌黑曲中显著上调的差异代谢物,明确了抑菌黑曲和黑曲的代谢功能差异,研究了目标代谢物香兰素、萘啶酸、2-甲基呋喃和黑色素的体外抑制乳酸菌的能力,并对它们的代谢途径进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

酱香型高温大曲来自贵州茅台酒股份有限公司,在大曲拆仓时从曲仓不同部位随机取样,经液氮处理后放于无菌自封袋中,保存于-40 ℃备用。其中114份样品为不同轮次黑曲样品,任取10份黑曲样品,碾碎后充分混合,BQ 1-1、BQ 1-2、BQ 1-3为混合黑曲样品的3个平行样,BBQ 1-1、BBQ 1-2、BBQ 1-3为抑菌黑曲1的3个平行样,BBQ 2-1、BBQ 2-2、BBQ 2-3为抑菌黑曲2的3个平行样,2株乳酸菌面包乳杆菌和耐酸片球菌由酱香型大曲中筛选获得。

MRS培养基,青岛海博生物技术有限公司;针头式过滤器,生工生物工程(上海)股份有限公司;分析纯香兰素、萘啶酸、2-甲基呋喃,阿拉丁;黑色素,默克;色谱级甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水,上海佰晔生物科技中心。

1.2 仪器与设备

HDPF-256电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;ZQZY-88BH振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;ZX-LGJ-2冷冻干燥机,上海知信实验仪器技术有限公司;RE-201D旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;UVmini-1285紫外可见分光光度计,岛津仪器有限公司;HVS-1000(-U)高级型洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;Vanquish超高效液相色谱仪、Q Exactive HFX高分辨质谱仪,赛默飞世尔科技公司;JXFSTPRP-24研磨仪,上海净信科技有限公司;PS-60AL超声仪,深圳市雷德邦电子有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 抑菌黑曲的筛选及其抑菌性研究

取9批共114份黑曲样品进行抑菌性试验,从中筛选具有抑制乳酸菌的样品,大曲样品粉碎后,称取10 g大曲加入30 mL蒸馏水4 ℃浸泡过夜,低温离心获得大曲样品的浸提液,真空冷冻干燥将浸提液浓缩10倍,过滤除菌获得无菌的大曲样品浸提液。将活化的乳酸菌菌液以1%接种量接种到等量添加大曲浸提液的MRS培养基中,对照用等量的无菌水替换,37 ℃培养12 h后,稀释不同梯度,平板培养,24 h后对平板菌落进行计数。

1.3.2 大曲代谢物提取

取100 mg样品至EP管中。加入1 mL甲醇(含1 μg/mL内标)后涡旋30 s,样品在35 Hz下均质4 min,然后在冰上超声5 min。均质化和超声处理重复3次。然后将样品在-40 ℃下孵育1 h,并在4 ℃下以12 000 r/min离心15 min。将获得的上清液贮存用于LC/MS分析[9]

1.3.3 LC-MS/MS分析

使用UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)与Q Exactive质谱仪联用的超高效液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。液相色谱A相为水相,含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水,B相为乙腈。采用如下洗脱梯度:0~1.0 min,1% B;1.0~8.0 min,1%~99% B;8.0~10.0 min,99% B;10.0~10.1 min,99%~1% B;10.1~12 min,1% B。柱温30 ℃。自动进样器温度为4 ℃,进样量为2 μL。QE HFX质谱仪能够在控制软件(Xcalibur,Thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。以下为ESI离子源条件:鞘气流速为45 Arb,辅助气流速为15 Arb,离子传输管温度400 ℃,全扫描分辨率为70 000,MS/MS分辨率为17 500,碰撞能量为NCE模式下20/40/60 eV,电离电压分别为4.0 kV(正)或-3.6 kV(负)。

1.3.4 数据处理

使用ProteoWizard将原始数据转换为mzXML格式。使用R并基于XCMS的内部程序用于峰检测、提取、对齐和积分[10]。XCMS包可以通过Bioconductor安装。具体信息请参考https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html。然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释。以下所有的代谢物数据分析选择MS质谱得分>0.6的代谢物进行。

1.3.5 主成分分析(principal component analysis,PCA)

使用SIMCA软件,对数据进行对数转换加Par格式化处理,然后进行自动建模分析[11]

1.3.6 正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)

SIMCA软件(V15.0.2)用于对数转换和UV格式化处理,以可靠地筛选组间的差异代谢物。通过OPLS-DA建模和第一主成分分析来评估模型的质量。使用7-flod交叉验证进行测试。然后,通过R2Y(模型对分类变量Y的可解释性)和Q2(模型的可预测性)来估计模型的准确性。最后采用置换检验随机多次改变分类变量Y的排列顺序得到不同的随机Q2值,进一步检验模型有效性[12]

1.3.7 差异代谢物筛选和火山图

t检验和方差分析等是单变量统计分析的方法,它们更关注代谢物的独立变化,为了防止使用单一数据分析方法造成的假阳性或模型过拟合,我们使用多元统计分析,P值<0.05和OPLS-DA模型中第一主成分(PC 1)的投影中的变量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)>1作为差异代谢物的筛选标准并绘制火山图[13]

1.3.8 抑菌物质对乳酸菌抑制效果验证

将上述数据分析得到香兰素、萘啶酸、黑色素和2-甲基呋喃4种抑菌物质设置不同浓度梯度过滤除菌,将活化的乳酸菌以1%接种量接入加入抑菌物质的培养基中,220 r/min摇床培养24 h,以不加抑菌物质的培养基作为对照,隔2 h测600 nm处的OD值。由于黑色素加入培养基后颜色深,测量误差较大,采用平板计数法测定抑菌效果,将黑色素溶解于1 mol/L氨水,旋转蒸发至黑色素溶液pH为7.0~7.5,过滤除菌后加入,以无菌水代替黑色素溶液作为对照,培养12 h后将加入黑色素的乳酸菌培养液稀释不同梯度,吸取15 μL点接在平板上,37 ℃培养24 h后计数。

1.3.9 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差异丰度分析

从大量的注释通路中找到有价值的代谢通路是代谢组学数据挖掘的一大难题。差异丰度得分是一种基于通路的代谢变化分析方法,可以直观清晰的展示相关代谢通路的在抑菌黑曲和黑曲上下调情况以及所属代谢类型[14]

2 结果与分析

2.1 抑菌黑曲的筛选及其抑菌性研究

如图1-A所示,对9批共114份黑曲样品做了抑菌性试验,发现绝大多数黑曲都不存在抑制乳酸菌的作用,仅3%黑曲样品存在显著抑制作用,取2份抑菌黑曲样品和1份黑曲样品进行计数。如图1-B、图1-C所示,与对照组及黑曲浸提液相比,抑菌黑曲浸提液加入培养基后,对乳酸菌有显著的抑制效果,对照组及加入黑曲浸提液后,菌落存活数为加入抑菌黑曲浸提液的1 000倍左右,抑菌黑曲1的抑制效果更强些,我们推测抑菌黑曲的抑菌作用可能与某些抑菌素有关,因此接下来对其代谢物进行了研究。

A-抑菌黑曲样品占比;B-样品及对照平板菌落生长情况;C-样品及对照平板菌落计数
图1 不同大曲浸提液对乳酸菌生长的影响
Fig.1 Effects of different Daqu extracts on the growth of lactic acid bacteria

2.2 抑菌黑曲和黑曲代谢物PCA

在不同样品中共检测到1 290种代谢物。所有样本的PCA得分散点图如图2所示,其中横坐标(PC1)和纵坐标(PC2)分别代表第一主成分和第二主成分的得分。不同颜色的散点代表不同的样本,散点分布越近,样本的代谢物种类和丰度越类似,如果样本距离越远,表示差异越大。如图2所示,所有样本都在95%置信区间内(Hotelling的T方椭圆)。该结果表明不同类型大曲的代谢物存在显著差异,但组内平行样品间无明显偏差。

图2 所有样本的PCA 模型的分数散点图
Fig.2 Score scatter plot for PCA model total

2.3 抑菌黑曲和黑曲OPLS-DA

在OPLS-DA中,在筛选出与分类变量无关的正交变量后,通过分析非正交变量和正交变量获得样品之间代谢物的差异和相关性。如图3-A和图3-B所示,PC 1的预测主成分得分以横坐标t[1]P显示,正交主成分得分以纵坐标t[1]O显示,不同形状和颜色的散点表示不同的样本。OPLS-DA评分结果显示抑菌黑曲的代谢物与黑曲有显著差异。

图3-C和图3-D中,横坐标代表置换检验的置换保留(与原模型的Y变量序列一致的比例,置换保留等于1的点就是R2YQ2的值),纵坐标分别代表R2YQ2的回归线。图中R2Y值足够接近1,说明模型充分反映了样品代谢物的真实情况。另外,Q2值与R2Y值相近,说明样本量足够,不会造成较大误差。因此,模型可以解释样本之间的差异。随机模型置换检验的Q2值低于原模型,Q2回归线与纵轴截距均<0。而且,Y变量的比例随着排列保留率的降低而增加,随机模型的Q2值与排列保留率的变化一致。这表明原始模型能够准确地反映样本的差异。

A-抑菌黑曲1与黑曲的OPLS-DA模型的分数散点图;B-抑菌黑曲2与黑曲的OPLS-DA模型的分数散点图;
C-抑菌黑曲1与黑曲的OPLS-DA模型的置换检验;D-抑菌黑曲2与黑曲的OPLS-DA模型的置换检验
图3 OPLS-DA的分析结果
Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA model

2.4 差异代谢物筛选和火山图

如图4所示,火山图中不同颜色的点是不同的代谢物。横坐标是两组之间每种代谢物的相对丰度倍数(以2为底的对数),纵坐标是指t检验的P值(以10为底的对数)。每种代谢物的VIP值以散点面积表示。散点越大,表示代谢物的VIP值越大。在本研究中,不同样品共检测到1 290种代谢物,抑菌黑曲1与黑曲相比有348种上调的差异代谢物,抑菌黑曲2与黑曲相比有445种上调的差异代谢物(P<0.05,VIP>1)。其中,抑菌黑曲1和抑菌黑曲2共同上调的差异代谢物259种,包括79种有机杂环化合物、65种有机酸及其衍生物、35种有机氧化合物、26种苯类、22种脂质和类脂分子、12种苯丙烷和聚酮化合物、5种生物碱及其衍生物、15种其他化合物。

通过以上筛选条件得到了259种在抑菌黑曲中显著上调的差异代谢物,由于数量过多,无法一一进行研究,因此,我们添加筛选条件,筛选259种物质中在抑菌黑曲和黑曲的相对丰度差异倍数在2倍以上的代谢物,获得81种P值<0.05,VIP值>1及差异倍数(fold change,FC)>2的物质,然后对81种物质按照相对丰度的高低进行排序。最后对相对丰度排名前20的物质进行深入研究(表1),根据相关研究报道,丰度排名前20的物质中,香兰素、萘啶酸和2-甲基呋喃对某些微生物存在抑制作用,赵建芬等[15]的研究表明,香兰素对大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用。萘啶酸是喹诺酮类抗菌药,对引起腹泻病的弯曲杆菌属有一定的抑菌作用[16]。2-甲基呋喃是美拉德反应的典型中间产物,许多美拉德反应都存在抑菌活性[17]。此外,我们发现丰度排名前20的物质中,包括酪氨酸和多巴,二者是黑色素合成的前体,同时,黑色素也是抑菌黑曲中显著上调的差异代谢物。研究表明,黑色素是酶促褐变的产物,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑菌活性[18]。香兰素和黑色素是苯类化合物,2-甲基呋喃和萘啶酸是有机杂环类化合物。因此,接下来我们对这4种物质体外抑制乳酸菌的活性进行研究。

2.5 抑菌物质对乳酸菌的抑制效果验证

将4种抑菌物质根据上述报道的抑菌特性,根据其最低抑菌活性及抑菌性能,设置不同浓度梯度培养乳酸菌,以大曲中筛选得到的面包乳杆菌和耐酸片球菌为指示菌,如图5所示,香兰素和2-甲基呋喃对乳酸菌有较强的抑菌作用,随着它们的浓度升高,其抑菌效果增强。萘啶酸对乳酸菌的抑制作用稍弱,当质量浓度达到0.1 g/L时,出现抑制作用。

A-抑菌黑曲1与黑曲中差异代谢物的火山图;B-抑菌黑曲2与黑曲中差异代谢物的火山图;C-抑菌黑曲中上调的差异代谢物分类及数量;
D-抑菌物质相对丰度热图
图4 抑菌黑曲与黑曲的差异代谢物筛选
Fig.4 Screening of differential metabolites of BBQ vs BQ
注:图A,B中散点的不同颜色表示代谢物在抑菌黑曲中是否上调;抑菌黑曲中上调的代谢物是红色的;抑菌黑曲中下调的代谢物
是蓝色的;灰色表示抑菌黑曲与黑曲没有显著差异

A-香兰素对面包乳杆菌生长的影响;B-香兰素对耐酸片球菌生长的影响;C-萘啶酸对面包乳杆菌生长的影响;D-萘啶酸对
耐酸片球菌生长的影响;E-2-甲基呋喃对面包乳杆菌生长的影响;F-2-甲基呋喃对耐酸片球菌生长的影响
图5 抑菌物质对乳酸菌生长的影响
Fig.5 The effect of bacteriostatic substances on the growth of lactic acid bacteria

如图6所示,黑色素随着浓度的升高,平板上生长的菌落数明显减少,抑制作用明显增强。大曲发酵是混菌发酵的过程,有成千上万种微生物发挥作用,产生数千种代谢物,香兰素、萘啶酸、2-甲基呋喃等代谢物在黑曲中积累,使其具有抑制乳酸菌的作用,形成抑菌黑曲。

表1 抑菌黑曲中显著上调的20种代谢物在
不同样本中相对丰度
Table 1 Relative abundances in different samples of 20
metabolites significantly up-regulated in BBQ

名称BBQ1BBQ2BQ(R)-2-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one0.003 658 30.002 751 30.000 629methyl n-formylanthranilate0.003 342 50.003 095 20.000 6955-methyl-2-furancarboxaldehyde0.001 998 50.002 752 70.000 941glyceraldehyde0.001 2310.001 379 80.000 575homoveratric acid0.001 159 50.004 242 30.000 39(-)-3-cyanomethyl-3-hydroxy-1H-indol-2(3H)-one0.001 115 50.001 042 40.000 389nalidixic acid0.001 094 50.001 310 40.000 233vanillin0.001 080 90.002 777 20.000 5793-methylcytosine0.000 918 20.001 867 30.000 232ricinine0.000 712 50.000 501 40.000 239N-[4′-hydroxy-(E)-cinnamoyl]-L-aspartic acid0.000 706 70.001 218 70.000 2193′-hydroxyhexobarbital0.000 685 20.000 760 70.000 313epoxy-hexobarbital0.000 533 80.000 652 10.000 211DL-dopa0.000 368 80.000 574 60.000 149bbtethal0.000 3340.000 535 20.000 134L-tyrosine0.000 332 20.000 512 10.000 152seryltyrosine0.000 314 20.000 351 48.86E-05perilla sugar0.000 304 20.000 470 70.000 1084-pyridoxic acid0.000 301 30.000 358 80.000 1212-methylfuran0.000 292 10.000 390 30.000 137

2.6 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差异丰度分析

如图7所示,氨基酸代谢中,只有酪氨酸代谢在抑菌黑曲中上调,说明抑菌黑曲的代谢方向主要为风味物质转换,该代谢途径的起始物质为酪氨酸,酪氨酸在一种多酚氧化酶-酪氨酸酶的催化下,经过氧化聚合作用,形成黑色素[19],黑色素在抑菌黑曲中上调,产生抑制乳酸菌的作用,这也解释了抑菌黑曲外观比黑曲更黑的原因。

A-平板图;B-菌落个数
图6 黑色素对乳酸菌生长的影响平板计数
Fig.6 Effect of melanin on the growth of lactic acid bacteria

图7 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差异丰度图
Fig.7 The KEGG pathway differential abundance map of BBQ vs BQ
注:图中通路的不同颜色表示通路所属不同的代谢分类,线段表示该通路的上下调情况,线段数值为正则表示该通路整体上调,反之,
表示通路整体下调;线段端点的大小表示该通路中被注释的物质数量

此外,大多数氨基酸代谢都在抑菌黑曲中下调,在黑曲中上调,说明抑菌黑曲中的氨基酸更倾向于与小麦中还原糖发生美拉德反应,形成很多有机杂环类代谢物,使得抑菌黑曲中存在极多的显著上调的有机杂环类差异代谢物,包括存在抑制乳酸菌活性的2-甲基呋喃和萘啶酸。而黑曲中氨基酸更倾向于代谢成小分子。

2.7 抑菌黑曲抑菌成分代谢网络分析

大曲发酵是固态发酵过程,大量微生物产生丰富的酶系,包括多种淀粉酶和蛋白酶,淀粉酶和蛋白酶水解原料小麦产生氨基酸和还原糖[20],酱香型大曲高温高湿的发酵环境及丰富的氨基酸和还原糖为美拉德反应提供了条件[21],氨基酸和还原糖经过聚合、缩合等反应,产生吡啶、吡咯、呋喃、吡嗪等有机杂环类物质,包括2-甲基呋喃和萘啶酸,2-甲基呋喃是由典型美拉德反应产物糠醛转化而来,各种有机杂环类物质经过复杂的转化最终生成棕色甚至是棕黑色的大分子物质类黑素。

如图8所示,制曲原料小麦中的氨基酸还能被微生物利用进入氨基酸代谢,苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸、肉桂酸和对香豆酸等在抑菌黑曲中显著下调,用于合成香兰素。下调的苯丙氨酸还用于形成酪氨酸进入酪氨酸代谢,该代谢通路上的酪氨酸、L-多巴、多巴色素和黑色素均在抑菌黑曲中上调,使黑色素在抑菌黑曲中积累,产生抑制乳酸菌作用。

图8 抑菌物质代谢网络
Fig.8 Metabolism network of antibacterial substances
注:红色表示在抑菌黑曲中显著上调的代谢物,蓝色表示在
抑菌黑曲中显著下调的代谢物

3 结论

利用非靶向代谢组学对抑菌黑曲和黑曲的代谢物进行解析,明确了抑菌黑曲中抑制乳酸菌的代谢物,并对抑菌物质的代谢过程进行了解析,为酱香型白酒的降酸问题提供理论依据从而达到提高白酒品质的目的。研究表明,抑菌黑曲和黑曲的代谢表型存在显著差异,抑菌黑曲中存在259种显著上调的差异代谢物,经过分析和体外抑菌性试验明确了香兰素,萘啶酸,2-甲基呋喃和黑色素4种具有抑制乳酸菌作用的代谢物。抑菌黑曲中各种氨基酸代谢显著下调,表明抑菌黑曲中氨基酸用于美拉德反应,产生大量杂环类物质包括2-甲基呋喃和萘啶酸,抑菌黑曲中酪氨酸代谢上调,产生具有抑菌效果的黑色素,香兰素是苯丙氨酸代谢的产物。以上的分析对于酱香型白酒降酸问题的解决提供理论基础,对白酒酿造提供优质大曲和白酒质量的提升有一定贡献。后期工作可以通过蛋白组学和宏基因组学对抑菌黑曲中抑菌成分的来源微生物和代谢途径做进一步解析。

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Analysis of functional components of antibacterial black Daqu in sauce-flavored Daqu based on non-targeted metabolomics

LUO Shuai1,2,3,ZHANG Qiaoling4,YANG Fan4,LU Jianjun4,PU Xiuxin4,ZHANG Juan1,3*,WANG Li4*

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)3(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)4(Kweichow Moutai Co. Ltd., Zunyi 564501, China)

ABSTRACT Sauce-flavored Daqu is the key link of Baijiu brewing, which provides abundant enzymes and flavor precursors for Baijiu brewing. However, over-proliferated lactic acid bacteria will increase the acidity of Daqu and reduce the saccharification power, fermentation power and alcohol yield. Antibacterial black Daqu (BBQ) is a special black Daqu (BQ) that inhibits lactic acid bacteria. Therefore, analyzing the key metabolites that inhibit lactic acid bacteria in BBQ will help to reduce the acidity of Daqu. This study analyzed the metabolites of BBQ and BQ using untargeted metabolomics and found 259 differential metabolites that were significantly up-regulated in BBQ. Vanillin, nalidixic acid, 2-methylfuran, and melanin were identified as potential bacteriostatic substances and confirmed by pure culture of lactic acid bacteria in vitro. Tyrosine metabolism was significantly up-regulated in BBQ, and the end product of this metabolic pathway was melanin. Vanillin is produced by the metabolism of phenylalanine. Frequent Maillard reactions in BBQ generated a large number of organic heterocycles including 2-methylfuran and nalidixic acid. Overall, the accumulation of vanillin, nalidixic acid, 2-methylfuran, and melanin in BQ resulted in its inhibitory activity against lactic acid bacteria. This research will help to reduce the acidity of sauce-flavored Baijiu by improving the quality of Daqu.

Key words sauce-flavored Daqu;antibacterial black Daqu;vanillin;nalidixic acid;2-methylfuran;melanin;lactic acid bacteria

第一作者:硕士研究生(张娟教授和王莉研究员为共同通信作者,E-mail:zhangj@jiangnan.edu.cn;WangliMoutai2021@163.com)

基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFC1605800);江苏省重点研发社发项目(BE2021624)

收稿日期:2022-02-08,改回日期:2022-03-11

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031082

引用格式:罗帅,张巧玲,杨帆,等.基于非靶向代谢组学分析酱香型大曲中抑菌黑曲的功能成分[J].食品与发酵工业,2022,48(14):16-23.LUO Shuai,ZHANG Qiaoling,YANG Fan, et al.Analysis of functional components of antibacterial black Daqu in sauce-flavored Daqu based on non-targeted metabolomics[J].Food and Fermentation Industries,2022,48(14):16-23.