为使食品免受食源性致病菌或腐败微生物污染并延长食品保质期，除采用低温、高盐(糖)或干燥等传统手段外，常在食品中添加抗菌保鲜剂以达到预期目的。化学防腐剂因易残留和存在潜在“三致”危害而受限[1]。抗菌肽因具有抗菌谱广、抑菌机制独特和不易产生耐药性等优势而成为食品抗菌保鲜领域的研究热点。食品是一个复杂多变的非线性灰色体系，食品组分、加工参数及贮运条件等内外部因素对抗菌活性发挥可能产生复杂影响。食品酸碱性及表面活性剂等可影响抑菌活性，如Nisin在酸性食品中可发挥较好抑菌活性，而中性或碱性条件则几乎无抑菌活性，酸处理能显著降低辣椒籽抗菌肽抑菌活性[2]，Tween-80能增强抗菌能力[3]。食品中金属阳离子对抗菌活性也可能产生复杂影响，如Fe2+使BSN-37抑菌活性消失[4]、Ag+使萝卜籽蛋白抑菌活性降低70%[5]、Ca2+可增强花椒籽蛋白抗菌活性[3]，Na+、Mg2+和Ca2+使BSN-37最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)上升6倍以上，Fe3+使MIC轻微下降[6]。前期研究发现，金属抗菌肽SIF4对金黄色葡萄球菌[7]和大肠杆菌[8]有较好抑菌活性，在模拟食品体系中保持较好抗菌活性[9]，但在食品内外部环境因素变化时抗菌活性衍变规律尚未明晰。本文以金黄色葡萄球菌为指示菌，研究食品内外部环境因素变化对SIF4抑菌活性影响的衍变规律，为其在食品抗菌保鲜中应用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
金属抗菌肽SIF4由课题组制备[7]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)，从菌种保藏中心获得。牛肉膏、胰蛋白胨，北京博星生物；胃蛋白酶、胰蛋白酶，庞博生物；蛋白酶K，Sigma；其他试剂均为国产分析纯。
Infinite M200 Pro多功能酶标仪，Tecan；LDZX-40SAI立式蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗；BBS-SSC超净工作台，济南腾览；DH-360电热恒温培养箱，北京科伟；HERMLEZ323K冷冻离心机，Hermle。
1.2 实验方法
1.2.1 相对抑菌活性测定
从菌种保藏斜面用接种环刮取2环S.aureus接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃恒温振荡(120 r/min)培养至对数生长期，准确吸取0.1 mL菌液(×108CFU/mL)均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基表面，将灭菌牛津杯置于培养皿中并加入供试品0.1 mL，4 ℃放置2 h使试液充分扩散至琼脂层，37 ℃ 恒温静置培养24 h并测定抑菌圈直径。抑菌活性计算如公式(1)所示：
抑菌活性
(1)
式中：A1为试验组平均抑菌圈直径，cm；A0为对照组平均抑菌圈直径，cm。
1.2.2 食品内部因素对抑菌活性的影响
(1)温度对抑菌活性的影响：取2×MIC的SIF4(MIC=0.2 μg/mL)5 mL，于25、37、50、60、70、80、90、100、121 ℃分别处理30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合(SIF4终浓度为1×MIC，下同)并测定相对抑菌活性。
(2)pH变化对抑菌活性的影响：参考WU等[10]方法并略作修改。取2×MIC SIF4若干份，用1 mol/L HCl或NaOH将pH调至2～12，室温放置1 h，pH回调至7.0，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
(3)金属阳离子对抑菌活性的影响：参考BOZIARIS等[11]方法并稍微修改。取SIF4若干份溶于0～200 mmol/L CaCl2、MgCl2、KCl和NaCl溶液(pH 7.4)中，使终浓度为2×MIC，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
1.2.3 食品外部因素对抑菌活性的影响
蛋白酶对抑菌活性的影响：参考KIM等[12]方法并略作修改。于2×MIC SIF4溶液中分别加入胃蛋白酶(37 ℃，pH 1.5)、胰蛋白酶(37 ℃，pH 8.5)和蛋白酶K(55 ℃，pH 7.5)，使酶终质量浓度分别为0.001、0.01、0.1、1 mg/mL，温育30 min后100 ℃灭酶5 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
反复冻融对抑菌活性的影响：将2×MIC SIF4进行反复冻融(-20 ℃冻结，常温解冻，冻融10次)，冻融后于5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
化学试剂对抑菌活性的影响：
(1)EDTA对抑菌活性的影响：配制浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/mL无菌EDTA溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
(2)Tween-80对抑菌活性的影响：配制质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL无菌Tween-80溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
(3)尿素对抑菌活性的影响：配制浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的无菌尿素溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
(4)十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)对抑菌活性的影响：配制质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL无菌SDS溶液，加入SIF4使终浓度为2×MIC，室温静置30 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液与S.aureus等体积混合并测定相对抑菌活性。
1.2.4 生物相容性分析(溶血活性分析)
参考STARK[13]方法并修改。取健康家兔血液收集于肝素钠管中，2 000 r/min离心10 min，倒掉血清，血细胞用预冷PBS(10 mmol/L，pH 7.4，含50 mmol/L NaCl PBS)重悬洗涤3次以除尽血清，血细胞用PBS重悬至8%。将1 024 μg/mL SIF4作2倍稀释并分别与等体积血红细胞悬液混合，37 ℃孵育30 min，3 000 r/min离心10 min，1 000 r/min离心10 min后，上清液用多功能酶标仪测定A490nm以观察红细胞血红蛋白释放程度。以PBS为阴性对照，0.1% Triton X-100为阳性对照。溶血活性计算如公式(2)所示：
溶血活性
(2)
式中：A1为抗菌肽和样品共育后吸光值；A0为阴性对照组吸光值；A2为阳性对照组吸光值。
1.2.5 试验数据处理
试验结果以平均值±标准偏差(n=3)表示，用Origin 2017绘制统计图，采用SPSS 25.0单因素ANOVA检验进行组间均数差异多重比较，两两比较方差齐性时采用最小显著性差异法，非齐性时使用塔姆黑尼T2方法，显著性水平α=0.05。
2 结果与分析
2.1 食品内部因素对抑菌活性的影响
2.1.1 温度对抑菌活性的影响
温度对SIF4抑菌活性影响结果如图1所示。
由图1可知，金属抗菌肽SIF4抑菌活性在25～70 ℃无显著差异(P>0.05)，80 ℃后略有下降，121 ℃ 仍保持(92.68±0.40)%抑菌活性，说明SIF4经不同温度处理后，对金黄色葡萄球菌抑菌活性并未发生明显变化，具备较好热稳定性，可能是由于SIF4为小分子抗菌肽，高温处理对结构影响甚微[14]，与朱张洪基[15]报道的SDLH抑菌蛋白热稳定性结论相悖，该抑菌蛋白常温表现较好抑菌活性，高温(50～80 ℃)稳定性较差，可能是由于该抑菌蛋白分子质量较大，高温处理破坏氢键，对空间结构产生影响，从而减弱抑菌活性，多数蛋白在45～50 ℃发生变性，而寡肽热稳定性相对较好[15]。
图1 温度对抑菌活性的影响
Fig.1 The effect of temperature on antimicrobial activity
注：字母相同表示组间差异不显著(P>0.05)，字母不同
表示组间差异显著(P<0.05)(下同)
2.1.2 pH变化对抑菌活性的影响
pH对SIF4抑菌活性影响结果如图2所示。
由图2可知，在pH 2～9，SIF4抑菌活性可保持在(93.98±0.30)%以上，说明SIF4在酸性、中性或偏碱性条件下有较好抑菌稳定性，可用于果蔬汁饮料等酸性食品抗菌保鲜。pH>10抑菌活性显著降低可能是由于强碱性环境下抗菌肽分子构象发生变化而影响其抗菌稳定性[16]。研究发现，pH=12时仍保持(85.54±0.28)%抑菌活性，说明SIF4具有较好酸碱适应性，在不同食品pH体系中具有较好的应用基础。鸭小肠抗菌肽在pH=7.0时抑菌活性最强，适用于中性食品体系，偏酸性(pH<6.0)或偏碱性(pH>8.0)食品体系抑菌效果均不理想，林蛙抗菌肽在pH 2～5.6稳定，pH>6抑菌活性明显下降，pH 8左右出现沉淀，适用中性或酸性食品体系，而辣椒籽抗菌肽在pH≥7时，抗菌活性随pH升高而显著升高(P<0.05)，pH=12处理4 h，抑菌活性比对照提高35.38%，适用于碱性食品体系使用，由此也可看出，不同抗菌肽的酸碱适应性存在显著差异。
图2 pH值对抑菌活性的影响
Fig.2 The effect of pH value on antimicrobial activity
2.1.3 金属阳离子对抑菌活性的影响
金属阳离子对SIF4抑菌活性影响如图3所示。
A-CaCl2;B-MgCl2;C-KCl;D-NaCl
图3 金属阳离子对抑菌活性的影响
Fig.3 The effect of metal cation on antimicrobial activity
由图3-A可知，50～200 mmo/L Ca2+对SIF4抑菌活性无显著影响(P>0.05)。李心丹等[17]发现，抗菌肽抑菌活性随Ca2+浓度增加而显著减弱(P<0.05)且呈良好负相关关系，但也有研究发现，Ca2+可增强抗菌肽抑菌活性，如Ca2+可使BSN-37对沙门氏菌MIC提升6倍以上，对鼠伤寒沙门氏菌MIC提升4倍；由图3-B可知，50～200 mmo/L Mg2+对抑菌活性无显著影响(P>0.05)，抑菌活性均保持在(99.28±0.78)%以上。Mg2+对花椒籽抗菌肽有显著抑制作用且与离子浓度呈正相关关系[16]，抗菌肽VR3在高浓度Mg2+时抑菌活性减弱近40%，且Mg2+比Na+抑菌活性更明显[18]；由图3-C可知，K+在50～200 mmol/L，试验组与对照组抑菌活性均无显著差异(P>0.05)，与李心丹等[17]结果一致，但与侯晓艳[16]结论不一致，她发现高浓度K+浓度时，NP-5抑菌活性下降了38.46%；由图3-D可知，在50～200 mmol/L Na+，试验组与对照组抑菌活性无显著差异(P>0.05)，与钟亨任[19]结果一致。结果表明，SIF4抑菌活性不受Na+、K+、Ca2+和Mg2+影响，可能为非金属依耐抗菌肽[20]。
2.2 食品外部因素对抑菌活性的影响
2.2.1 蛋白酶对抑菌活性的影响
蛋白酶对SIF4抑菌活性影响如图4所示。
A-胃蛋白酶；B-胰蛋白酶；C-蛋白酶K
图4 蛋白酶对抑菌活性的影响
Fig.4 The effect of proteinase on antimicrobial activity
由图4-A可知，胃蛋白酶处理后抑菌活性与对照组无显著差异(P>0.05)，说明SIF4具有较好的胃蛋白酶耐受性。侯晓艳[16]发现，胃蛋白酶可显著降低NP-2、NP-5和NP-6抑菌活性，coagulin甚至可被胃蛋白酶失活[21]。胃蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸，倾向于剪切氨基端或羧基端为芳香族氨基酸和亮氨酸的肽键，SIF4具有较好的胃蛋白酶耐受性可能与其金属螯合载体相对分子质量较小及氨基酸组成有关，可能不含酶切位点[22]。由图4-B可知，0.001～0.1 mg/mL胰蛋白酶处理后，SIF4抑菌活性与对照组也无显著差异(P>0.05)，0.1、1.0 mg/mL胰蛋白酶处理后，抑菌活性略有下降，但仍可保持(97.40±0.87)%以上抑菌活性，coagulin可被胰蛋白酶失活[21]。胰蛋白酶主要作用于精氨酸和赖氨酸羧基端，SIF4具有较好的胰蛋白酶耐受性与其氨基酸组成有关，其在食品模拟体系中的稳定性与课题组前期研究的胃肠耐受性结论一致[22]；由图4-C可知，经0.001、0.01 mg/mL蛋白酶K处理后，SIF4抑菌活性与对照组无显著差异(P>0.05)，经0.1、1.0 mg/mL蛋白酶K处理后，与对照组相比有统计意义显著下降(P<0.05)，但仍分别有(92.52±0.71)%和(87.98±0.54)%抑菌活性，说明SIF4具有较好蛋白酶K耐受性。抗菌肽抑菌活性可被蛋白酶K失活(如bacthuricin F4)[23]或不受蛋白酶K影响(如B.laterosporus S62-9抗菌肽)[24]，抗菌肽酶耐受性的差异与抗菌肽氨基酸序列长短及氨基酸组成有关[23]。
2.2.2 反复冻融对抑菌活性的影响
反复冻融对SIF4抑菌活性影响如图5所示。
图5 反复冻融对抑菌活性的影响
Fig.5 The effect of freeze-thaw cycle on antimicrobial activity
由图5可知，SIF4经6次冻融处理后，抑菌活性与对照组无显著差异(P>0.05)，抑菌活性为(99.00±0.81)%，随后略有下降，冻融10次时，抑菌活性仍保持(82.90±0.87)%，表明SIF4具有较好冻融稳定性，与抗菌肽Brevilaterin冻融稳定性一致[25]。冻融稳定性差的抑菌蛋白(肽)应尽量避免反复冻融操作。
2.2.3 化学试剂对抑菌活性的影响
化学试剂对抑菌活性的影响如图6所示。
A-EDTA；B-Tween-80；C-尿素；D-SDS
图6 化学试剂对抑菌活性的影响
Fig.6 The effect of chemical reagent on antimicrobial activity
由图6-A可知，EDTA在0.2～1.0 mmol/mL时，抑菌活性与对照组均无显著差异(P>0.05)，表明EDTA对SIF4抑菌活性影响较小。EDTA可破坏阴性细菌外膜脂多糖结构，如EDTA可协同增强Enterocin T1和Plantarcin Q7抑菌活性；由图6-B可知，Tween-80对SIF4抑菌活性无显著影响(P>0.05)，与WORAPRAYOTE等[26]结论一致。有研究发现，Tween-80能增强抑菌活性，可能是因为Tween有助抗菌肽在琼脂平板中充分扩散[24]；从图6-C可知，0.2～0.8 mol/L尿素对SIF4抑菌活性无显著影响(P>0.05)，浓度为1.0 mol/L时，抑菌活性仍可保持(97.43±0.54)%，说明尿素对抑菌活性影响较小，与LIU等[27]基本一致，但WORAPRAYOTE研究发现，尿素可显著降低抗菌肽抑菌活性[26]；由图6-D可知，0.2～0.4 mg/mL SDS对抑菌活性无显著影响(P>0.05)，0.6 mg/mL上升到0.8、1.0 mg/mL时，抑菌活性从(98.75±0.41)%略降至(97.97±0.44)%和(97.81±0.75)%，具有较好抑菌稳定性，可能是由于SDS有利于抗菌肽α-螺旋空间结构形成，对维持其空间结构稳定和增强抑菌活性有重要意义[28]。董新颖发现，SDS可显著降低B.laterosporus S62-9抑菌活性(仅残存6.69%)，可能是由于该抗菌肽分子量较大，SDS处理可使抑菌蛋白变性，从而显著减弱其抗菌活性。SIF4经SDS作用后，抗菌活性仍可保持(97.81±0.75)%以上，说明金属抗菌肽SIF4为分子质量较小的寡聚抗菌肽。
2.3 生物相容性
SIF4对血红细胞生物相容性结果如表1所示。
表1 SIF4对血红细胞生物相容性结果
Table 1 The biocompatibility of SIF4 on blood cells
质量浓度/(μg·mL-1)溶血活性/%质量浓度/(μg·mL-1)溶血活性/%Triton X-100100a320.28±0.02bPBS0b640.37±0.02b20.04±0.01b1280.54±0.05c40.09±0.02b2561.99±0.12d80.16±0.03b5122.79±0.08e160.23±0.02b1 0245.48±0.32f
注：Triton X-100试验组为阳性对照，PBS试验组为阴性对照;不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
研究发现，PBS试验组未观察到溶血现象，Triton X-100试验组溶血率为100%。由表1可看出，SIF4对血红细胞均具较好生物相容性，表现较低溶血活性，即使在1 024 μg/mL时，溶血活性也仅为(5.48±0.32)%，远超过其MIC浓度，说明SIF4对动物细胞几乎无细胞毒性，具有较好生物相容性和生物安全性。
3 结论
抗菌肽能否适应食品内外部环境变化是制约其在食品抗菌保鲜领域中应用的基础。本试验以金黄色葡萄球菌为指示菌，研究了食品内外部环境因素变化对抑菌活性的影响。研究发现，金属抗菌肽SIF4具有较好热稳定性和酸碱耐受性，常见金属阳离子对抑菌活性无显著影响(P>0.05)，胃蛋白酶和胰蛋白酶对抑菌活性影响较小，具有很好胃肠消化酶耐受性，低浓度蛋白酶K处理对抑菌活性无显著影响(P>0.05)，蛋白酶K浓度增加，抑菌活性有所减弱，但仍可保持较高抑菌活性；有较好的冻融稳定性。EDTA和Tween-80对抑菌活性无显著影响(P>0.05)，低浓度SDS(<0.4 mg/mL)和尿素(<0.8 mol/L)对抑菌活性无显著影响(P>0.05)；具有很好的生物相容性和生物安全性，对血红细胞有极低溶血活性。研究认为，在常见食品内外部因素变化过程中，SIF4可保持较好的抑菌活性和生物相容性，可作为一种新型抑菌剂用于食品抗菌保鲜，可通过抑制致病微生物和腐败微生物增殖来增强食品的抗菌保鲜，有很好的应用前景。
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