中国的牦牛数量位居全球第一，大约有1 400万头牦牛生活在中国高海拔地区。在全球的牦牛中，中国的牦牛占92.8%，在牧民生活中，牦牛的皮毛、肉、奶甚至粪便均发挥着重要作用；除此之外，高原上的牦牛对牧民出行十分重要，是当地经济发展的重要组成部分[1]。牦牛的生存环境大多为高山、草原，必须适应极寒、高海拔、低氧和高太阳辐射，因而牦牛产奶量和乳成分具有季节性，受品种、奶牛龄、胎次、体况、牧草品质、挤奶时间等因素的影响，其产奶量较低。牦牛乳的脂肪球比普通牛乳大，乳脂含量高，乳中干物质、乳蛋白和乳糖等营养物质的含量比普通牛乳都要高[2]。
我国有关牦牛的研究大都集中在青海高原型牦牛、九龙牦牛、麦洼牦牛和甘肃天祝白牦牛等品种[3]，而对新疆帕米尔牦牛的研究鲜有报道。帕米尔牦牛分布在中国新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州和喀什地区境内的帕米尔高原，平均海拔3500米以上，这里山脉纵横交错，地形崎岖复杂，冬季漫长，气温低。高原上广阔的牧场和山地冰川滋养了帕米尔高原上的牦牛。牦牛乳是当地常见的乳源，它为人们提供重要的蛋白质、脂肪和维生素[1,4]。从婴幼儿到老年人，帕米尔牦牛乳始终是当地居民重要的食物来源，且关于帕米尔牦牛乳过敏的症状较为少见。有报道称牦牛乳有抗疲劳[5]、调节全身免疫反应的作用；能抑制与缺血性心血管疾病和Ⅱ型糖尿病有关的普氏菌的生长，降低某些代谢性疾病和传染病发生的风险[6]。另外，本课题组前期研究发现，帕米尔牦牛乳中蛋白质含量较高(4.3%)。牦牛乳酪蛋白水解物具有清除自由基和抗炎功效[7]。酶解后的牦牛乳酪蛋白可形成抗高血压肽，作为营养强化剂用于高附加值功能性食品的生产[8]。乳清蛋白含有乳中大部分营养成分，由于其具有丰富的生物活性以及突出的功能特性，可成为多种食品组分的替代品，同时也作为一种可靠的蛋白质来源，在食品行业中发挥重要作用[9]。乳清蛋白中的α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-La)含有色氨酸、赖氨酸等人体必需氨基酸，能够结合Ca2+、Zn2+等金属离子，促进矿物质吸收，还具有调节乳糖合成的作用[10-11]。
本研究旨在对帕米尔牦牛乳乳清蛋白和酪蛋白进行分离，并对α-La进行分离纯化，以期为帕米尔牦牛乳的研究提供理论支持，促进新疆帕米尔牦牛产业发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2019年7月从新疆维吾尔自治区克孜勒苏柯尔克孜自治州阿合奇县牧场采集100头帕米尔牦牛乳样本，混合后于-80 ℃冷冻保藏备用。
二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒、预染蛋白质Marker，北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝(R250)，南京三舒生物科技；十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上海依赫生物；甘氨酸，盖德化工；三异丙基硅烷(Tis)，上海源叶生物科技有限公司；甲醇、冰醋酸，天津富宇精细化工。
1.3 仪器与设备
FD-1A-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；NKY6120凯氏定氮仪，上海鸿祎；TS-80C摇床，上海天呈；DYY-6C垂直电泳，北京六一生物；QUANTUM-CX5凝胶成像仪，法国Vilber公司；RC-LX-HR165A离心机、MULTISKAN Sky全波长扫描酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 新疆帕米尔牦牛脱脂乳的制备
新疆帕米尔牦牛乳于4 ℃解冻，取解冻后牦牛乳样品离心，设定参数为：9 000 r/min，15 min。离心后浮在上层的乳脂肪用纱布过滤去除，重复离心多次直至乳脂肪除净，得脱脂乳。
1.3.2 乳清蛋白的分离与测定
脱脂乳中加入10%(体积分数)冰醋酸，调节pH至4.6，40 ℃ 水浴30 min，于4 ℃冰箱中过夜后，4 ℃冷冻离心，设置参数为9 000 r/min，15 min。反复多次离心直至完全去除上层乳脂肪后，上清液用纱布过滤，得到乳清蛋白，测定含量。
1.3.3 酪蛋白的分离与测定
取1.3.1中的沉淀，首先温水洗涤1次，后用蒸馏水洗涤2次，洗涤过程中将酪蛋白进行充分粉碎，将残留在酪蛋白中的可溶性蛋白充分除去，每次洗涤后离心，设置参数为8 000 r/min，离心5 min，沉淀即为粗酪蛋白。将粗酪蛋白用30%(体积分数)的乙醇清洗、抽滤；再用乙醚、乙醇混合溶液洗涤并进行抽滤；最后用30 mL乙醚洗涤2次并抽滤，置于烘箱中在55 ℃环境下干燥，得到纯化后的酪蛋白，使用凯氏定氮进行酪蛋白含量测定。
1.3.4 SDS-PAGE
将样品与4×变性样品缓冲液(20 μL)混匀，100 ℃ 水浴保持5 min使蛋白变性，变性结束后在4 ℃ 条件下12 000 r/min离心10 min，取上清备用。配制5%的浓缩胶及12%、15%的分离胶，凝胶的厚度为0.75 mm，取上清溶液，上样10 μL，蛋白标准分子质量Marker 5 μL。调节初始工作电压为100 V恒压，开始电泳。样品进入分离胶后，工作电压调至120 V恒压。当溴酚蓝染料前沿迁移至凝胶底部大约0.5 cm时，停止电泳，取出凝胶。用考马斯亮蓝染色液R-250摇床染色40 min后，回收染液，蒸馏水清洗，加入脱色液摇床脱色，更换脱色液，直至显现清晰的条带。最后采用BIO-RAD凝胶成像系统拍照成像。
1.3.5 硫酸铵分级沉淀
向乳清蛋白中加入硫酸铵，待溶液饱和浓度达到40%后，在4 ℃下静置约4 h，离心后沉淀备用。继续向上清中加入硫酸铵提高溶液饱和度，使其达到50%，不断重复上述操作，分别收集硫酸铵饱和浓度为50%、60%、70%、80%和90%时的沉淀。将上述沉淀加入10 mL蒸馏水复溶，置于透析袋中在4 ℃下对该缓冲溶液进行透析，每隔2 h换水，并用10 g/L的BaCl2不断检测，直到透析液中没有白色沉淀出现为止。
1.3.6 离子交换层析
柱材的溶胀：称取10 g DEAE-Sepharose溶于200 mL蒸馏水中，浸泡48 h，使之充分溶胀，备用。柱子规格为16 mm×60 cm。过程如下：
装柱及平衡：脱气活化后，装柱，用离子平衡缓冲液过柱，流速为2.0 mL/min；
上样：平衡过程中，检测系统的基线表现稳定不变时，阴离子柱即平衡结束。取适量样品上样；
平衡洗脱：未被吸附的杂蛋白用流速为2.0 mL/min的平衡缓冲液进行洗脱；
梯度洗脱：用含0～0.5 mol/L NaCl的连续梯度磷酸盐缓冲液将吸附能力不同的蛋白进行洗脱，梯度洗脱的流速设定为1 mL/min。
1.4 数据处理
每组实验数据平行测定3次，采用Excel 2019软件对实验数据进行整理，并以
表示；图片采用PowerPoint 2019软件处理；蛋白质用Image Lab 3.0软件推算分子质量。
2 结果与分析
2.1 帕米尔牦牛乳乳清蛋白和酪蛋白的分离及含量测定
采用等电点沉淀法初步分离了帕米尔牦牛乳中的乳清蛋白与酪蛋白，分别测定其含量。如表1所示，脱脂乳中总蛋白质含量为(2.81±0.23) g/100mL，其中乳清蛋白含量为(1.20±0.02) g/100mL，酪蛋白含量为(1.61±0.22) g/100mL，即乳清蛋白和酪蛋白质量比为43∶57。众多研究发现，牛乳中乳清蛋白与酪蛋白的比例为2∶8，甘肃牦牛为17∶83[12]，人初乳为 8∶2，成熟早期为6∶4，哺乳后期为1∶1[13]，马乳和驴乳分别为52∶48、55∶45[14]。与这些文献比较，帕米尔牦牛乳与其他哺乳动物乳清蛋白和酪蛋白比例存在较大的差异，这可能是由于品种、牦牛龄、胎次、体况、牧草品质等多种因素的不同而引起的，但较接近于人乳，因此，帕米尔牦牛乳更适合开发婴幼儿奶粉。
对帕米尔牦牛乳中蛋白质进行了分离，用分子质量为11～245 kDa的标准标记蛋白来估计其中蛋白质的分子质量(图1)。通过蛋白质分子质量可以看出，帕米尔牦牛乳中蛋白主要有α-La(12 kDa)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg，18.3 kDa)、酪蛋白(αs-CN 30 kDa、β-CN 25 kDa、κ-CN 21 kDa)、血清白蛋白(serum albumin，SAB，68 kDa)、乳铁蛋白(lactoferrin，LF，80 kDa)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG，150 kDa)，这些结果与前人文献结果一致[15]。由图1能够看出，酪蛋白在帕米尔牦牛乳中的含量最高，乳清蛋白紧随其后。将脱脂乳的酪蛋白沉淀后即得到了乳清蛋白，乳清蛋白所含营养物质丰富，是乳清中活性成分的来源，其中含有的α-La、β-Lg、SAB、LF和IgG等均是具有生物活性的功能蛋白[16]，对人类健康发挥着重要作用。
表1 帕米尔牦牛乳中乳清蛋白及酪蛋白含量与纯度
Table 1 Content and purity of whey protein and
casein in Pamir yak milk
指标含量/[g·(100mL)-1]比例/%乳清蛋白1.20±0.0243酪蛋白 1.61±0.2257总蛋白 2.81±0.23100
M-蛋白Marker；1，2-脱脂帕米尔牦牛乳
图1 帕米尔牦牛乳蛋白SDS-PAGE图谱
Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of proteins in Pamir yak milk
2.2 乳清蛋白中小分子蛋白质的分离
乳清蛋白是品质最佳的蛋白之一，它几乎包含了人生长发育的必需氨基酸，并且有抑制肿瘤[17]、促进骨形成、抑制骨吸收[18]、降血糖[19]等作用，是新一代超级食品，对人体健康有着重大意义。因此，本文对帕米尔牦牛乳清蛋白中的小分子蛋白进行了分离(图2)。与大多数其他哺乳动物乳一样，帕米尔牦牛乳乳清蛋白中出现的蛋白质条带分别为α-La、β-Lg、SAB、LF和IgG，均为乳清蛋白中的小分子蛋白，这些蛋白是具有生物活性的功能蛋白。牛乳、山羊乳与人乳中乳清蛋白含量分别是0.6、0.6和0.7 g/100mL[20]，而帕米尔牦牛乳中乳清蛋白含量[(1.20±0.02) g/100mL]比牛乳和山羊乳多1倍，同时高于人乳，这些表明帕米尔牦牛乳乳清蛋白营养价值高，是一种具有潜在经济效益的功效蛋白质。
M-蛋白Marker；1、2、3-帕米尔牦牛乳乳清蛋白
图2 乳清蛋白SDS-PAGE图谱
Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of whey protein
2.3 酪蛋白中小分子蛋白质的分离
酪蛋白是是良好的蛋白补充剂及添加剂。酪蛋白在乳中与磷酸钙结合后形成球形复合物而存在，称为酪蛋白胶束，尽管不同乳中的酪蛋白胶束结构和组成有较大差异，牛乳酪蛋白中含有牛乳中72%的钙和48%的磷[21]，因此乳中的酪蛋白在改善骨质疏松症、软骨病和佝偻病中可能有重大意义。因此，本文对帕米尔牦牛乳酪蛋白中的小分子蛋白进行了分离(图3)。根据分子质量，判断图中出现的蛋白条带分别为α-CN、β-CN和κ-CN，电泳图谱未见杂条带出现，表明等电点沉淀法可以将帕米尔牦牛乳中酪蛋白初步分离。酪蛋白广泛存在于牛、羊和人等哺乳动物乳中，是人体必须氨基酸和生物活性肽的来源，牛乳蛋白中80%为酪蛋白[22]。与帕米尔牦牛乳中酪蛋白含量[(1.61±0.22) g/100mL]比较，牛乳(2.7 g/100mL)和山羊乳(2.1 g/100mL)酪蛋白含量较高，乳中酪蛋白是主要的过敏原[23]，会导致特应性皮炎或湿疹、鼻炎、哮喘、呕吐、反复腹泻、腹痛等反应发生[24]。因此，本研究间接地解释了新疆、西藏牧民，尤其是帕米尔高原牧民用牦牛乳喂养婴儿以补充母乳，而不会导致过敏性反应的原因。
M-蛋白Marker；1、2、3-帕米尔牦牛乳酪蛋白
图3 酪蛋白SDS-PAGE图谱
Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of casein
2.4 α-La的纯化
α-La由乳腺上皮细胞合成，所有哺乳动物乳中均存在，是乳清蛋白中对热最稳定的蛋白，也是唯一一种能结合钙的乳清蛋白成分。α-La中含有丰富的必需氨基酸，并且氨基酸的比例、结构和功能特性与人乳都非常相似，可作为功能性添加剂加入奶粉中用来减少与人乳喂养之间的营养差异。此外，α-La色氨酸含量高，因而具有缓解压力、改善情绪和提高睡眠质量的作用，在婴儿配方食品、保健食品和药物中应用广泛[25]，因此，帕米尔牦牛乳中α-La的分离纯化具有重要意义。在α-La的分离纯化过程中，由于其分子质量和理化性质与β-Lg相似，所以β-Lg的去除是关键一步。
2.4.1 硫酸铵分级沉淀
使用饱和浓度为40%、50%、60%、70%、80%和90%的饱和硫酸铵溶液沉淀乳清蛋白，根据不同蛋白质在不同浓度盐溶液中溶解度不同来分离蛋白，然后使用SDS-PAGE方法将帕米尔牦牛乳乳清蛋白分级沉淀后得到的组分进行分离，结果如图4所示。在硫酸铵饱和浓度为40%、50%、60%和70%时，电泳图谱出现多个蛋白质条带，表明40%～70%的饱和硫酸铵溶液无法将乳清蛋白分离出来。当硫酸铵饱和浓度为80%时，在分子质量11～20 kDa存在蛋白质条带，根据分子质量大小初步判定为α-La和β-Lg。硫酸铵分级沉淀未能将帕米尔牦牛乳清蛋白中的β-Lg除去，这与成希飞[26]的结果相符，他在硫酸铵饱和浓度60%时分离乳清蛋白，得到了α-La、β-Lg和牛血清蛋白。当硫酸铵饱和浓度升高至90%时，泳道内基本不存在蛋白质条带，这表明饱和硫酸铵溶液浓度过高，帕米尔牦牛乳清蛋白已经基本沉淀完全。
将饱和硫酸铵浓度为80%时分离的蛋白质组分和α-La标准品进行SDS-PAGE，结果如图5所示。帕米尔牦牛乳乳清蛋白组分中的蛋白条带和α-La标准品的条带一致，表明饱和浓度为80%的硫酸铵可以将α-La分离出来，但未能完全除净其中的β-Lg。α-La和β-Lg不易分离，王浩等[27]使用反相高效液相色谱分离脱脂牛乳主要蛋白时，α-La和β-Lg一起洗脱出来，出现的色谱峰小且宽，因此，在α-La的纯化过程中，β-Lg成为分离的难点。
M-蛋白Marker；1～6-分别为饱和浓度为40%、50%、60%、70%、
80%和90%硫酸铵溶液中分级沉淀的帕米尔牦牛乳乳清蛋白
图4 硫酸铵分级沉淀SDS-PAGE图谱
Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis diagram of
ammonium sulfate fractionation precipitation
M-蛋白Marker；1-硫酸铵分级沉淀后的α-La；2泳道为α-La标品
图5 纯化后α-La与α-La标准品SDS-PAGE图谱
Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis diagram of α-La and
α-La standard products
2.4.2 DEAE-Sepharose离子交换层析纯化α-La
人乳清蛋白中α-La含量最高，占乳清蛋白的36%，几乎不含β-Lg[28]，乳清蛋白中的β-Lg也是一种过敏原[29]，β-Lg的脱除在乳品加工过程中至关重要。但由于α-La和β-Lg的理化性质相似，分子质量差别也较小，想要将两者分离是一个难点。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的离子组分与交换剂上的平衡离子之间进行各种可逆离子交换时的结合力大小的差异而进行分离的一种层析方法。由于蛋白质处于不同的pH条件下带电状况不同，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。将硫酸铵饱和浓度为80%时分离出的牦牛乳蛋白组分再用AKTA蛋白纯化仪和DEAE-Sepharose离子交换层析进行提纯，结果如图6和图7所示。
图6 帕米尔乳清蛋白DEAE-Sepharose离子交换层析图谱
Fig.6 DEAE-Sepharose ion exchange chromatogram
M-蛋白Marker；1-离子交换层析后的α-La；2-α-La标品
图7 DEAE-Sepharose离子交换层析蛋白质峰SDS-PAGE
图谱
Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis diagram of protein peaks in
DEAE-Sepharose ion exchange chromatography
DEAE-Sepharose离子交换层析蛋白质峰截流液的电泳图谱中只出现唯一的蛋白条带，且与α-La标准品条带的分子质量一致。这表明DEAE-Sepharose离子交换层析能够较完全的除去其中的β-Lg，得到高纯度的α-La。蒋红玲[30]采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析先将脱脂牛乳乳清蛋白中α-La洗脱，再将β-Lg洗脱，从而将α-La和β-Lg的混合物有效分离，这结果与本研究结果相符。由此可见，硫酸铵分级沉淀结合层析法对β-Lg的分离效果较好，可用于帕米尔牦牛乳α-La的分离纯化。
3 结论
通过等电点沉淀和SDS-PAGE的方法对新疆帕米尔牦牛乳中所含的蛋白进行分离，得出帕米尔牦牛乳总蛋白含量为(2.81±0.23) g/100mL，其中乳清蛋白和酪蛋白的含量分别为(1.20±0.02)、(1.61±0.22) g/100mL，并且乳清蛋白和酪蛋白的质量比为43∶57；再次，饱和度为80%的硫酸铵分级沉淀乳清蛋白可以将α-La分离出来，但伴有β-Lg；因此，再用DEAE-Sepharose离子交换层析分离提纯后，可将β-Lg完全除去，得到高纯度的α-La，以上结果为新疆帕米尔牦牛产业的发展提供了理论支撑，为当地牧民经济收入的提高做出一定的贡献。
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