随着人们生活水平的提高以及健康观念的增强，营养丰富、风味独特且易于消化吸收的酸奶受到了越来越多消费者的青睐，酸奶市场规模逐年扩增。虽然市面上酸奶产品层出不穷，但是现有酸奶产品同质化现象严重。随着消费者对于营养功效的需求日益提高，营养强化型酸奶的开发逐渐成为研究热点[1]。开发富含功能因子的营养强化型酸奶，进一步提高酸奶的营养价值，对于酸奶行业发展具有重要意义。目前，已有研究利用功能性油脂或天然活性提取物对酸奶进行营养强化。具有多种有益健康的功能食品已被报道为功能食品的十大发展趋势之一，不同功能因子组合间增效作用也已被报道，这些都驱动了富含多种功能因子的营养强化型酸奶的研究发展。
鱼油富含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等多不饱和脂肪酸，对促进大脑发育、改善视力以及保护肝脏等具有重要作用。但是，水不溶性及鱼腥味限制了鱼油在酸奶产品中的应用；而且，EPA和DHA的高不饱和双键极易氧化降解，产生自由基、氢过氧化物等不稳定的中间化合物以及次级氧化产物，导致营养和感官品质的下降[2]。添加抗氧化剂可以在一定程度上抑制鱼油的氧化，如绿茶多酚可以有效地改善鱼油的氧化稳定性，植物甾醇也可以防止多不饱和脂肪酸的氧化[3-4]。白藜芦醇是天然多酚化合物，具有很强的抗氧化性，并具有抗炎、保护心血管以及预防动脉粥样硬化等功效，但低水溶性、化学不稳定性等问题同样不利于其在酸奶中的应用[5]。利用喷雾干燥技术将功能因子包埋于微胶囊粉末，可以提高功能因子的溶解度、稳定性，掩盖其不良风味，使得低水溶性功能因子能够应用于酸奶中，提高酸奶营养价值。
乳清分离蛋白(whey protein isolate，WPI)具有良好的乳化性，常作为微胶囊壁材，包埋和保护芯材。利用谷氨酰胺转移酶处理可以形成ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共价键，能够改善乳清分离蛋白性能[6]。阿拉伯胶(gum arabic，GA)是一种阴离子多糖，具有乳化性，不但可以吸附在油-水界面，而且可以提高微胶囊粉末玻璃化转变温度，降低结块性，改善贮藏稳定性[7]。在本课题组的前期研究中，利用喷雾干燥技术，以酶交联乳清分离蛋白以及阿拉伯胶作为壁材，制备得到鱼油和白藜芦醇共包埋微胶囊粉末，鱼油和白藜芦醇包埋率分别为(89.58±0.56)%、(88.72±1.02)%[8]。本研究将鱼油微胶囊粉末、鱼油和白藜芦醇共包埋微胶囊粉末添加至凝固型酸奶中，探究微胶囊粉末对于酸奶感官品质、乳酸菌数、pH、持水力、功能因子(EPA、DHA、白藜芦醇)稳定性以及氧化稳定性的影响，为设计开发具有功能因子的营养强化型酸奶提供一定理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳清分离蛋白(纯度92%)、酸奶发酵剂(Yo-MixTM305 LYO 100 DCU)，美国Davisco食品国际公司；阿拉伯胶、三氟化硼-甲醇溶液(14%)，Sigma-Aldrich公司；谷氨酰胺转胺酶(transglutaminase，TGase)，泰兴市东圣生物科技有限公司；反式-白藜芦醇(纯度>98%)，上海生工生物工程有限公司；鱼油(食品级)，上海贺普实业有限公司；脱脂牛奶(伊利)、白砂糖，无锡欧尚超市；甲醇(HPLC级)，美国AQA公司；过氧化氢异丙苯，北京伊诺凯科技有限公司；正己烷(色谱标准物)、异丙醇、异辛烷、正丁醇、盐酸(GR)、硫氰酸铵、氯化钡、硫酸亚铁、无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠，均为分析纯，国药集团(上海)化学试剂有限公司；实验过程所用水均为Milli-Q超纯水。
1.2 仪器与设备
分析天平、EL3002电子天平、EF20型pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；5804R型冷冻离心机、5424R型冷冻离心机、移液枪，艾本德中国有限公司；磁力搅拌器、漩涡混合仪，德国IKA公司；IKA T25高速分散机、AH-2100型高压均质机(配有SDC-6智能节能恒温槽)，TS75工业系统有限公司；B-290实验室型喷雾干燥仪，瑞士Büchi有限公司；HS-800D恒温水浴槽，中国太仓华利达公司；恒温培养箱，上海精学科学仪器有限公司；CP100 NX超速离心机，日本日立公司；DC-24型氮吹仪，上海安普科学仪器有限公司；GC-2010PLUS气相色谱仪(全自动液体/顶空，FID/FTP/FPD)，日本岛津公司；UV-1800紫外可见分光光度计，苏州普金生物科技有限公司；YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-1FD超净工作台，无锡凯派克斯科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 微胶囊粉末的制备
配制25%(质量分数)WPI溶液、35%(质量分数)阿拉伯胶溶液，搅拌使它们充分溶解后调节pH至7.0，置于4 ℃备用。根据WPI质量加入转谷氨酰胺酶(8 U/g蛋白)，在50 ℃条件下水浴加热1.5 h，然后将酶交联的WPI(TG-WPI)溶液置于冰盒中，后续实验均在冰浴条件进行。参考BAKRY等[9]的方法制备鱼油微胶囊粉末。在TG-WPI 溶液中加入一定量超纯水稀释后加入鱼油，于16 000 r/min下剪切2 min，获得粗乳液；然后于10 ℃、50 MPa条件下均质3次，获得乳状液。乳状液中含17.5% TG-WPI以及11.67%鱼油。加入阿拉伯胶搅拌0.5 h，最终乳状液中含15%(质量分数，下同)TG-WPI、5%阿拉伯胶、10%鱼油。使用Büchi B-290实验室型喷雾干燥仪，在进口温度170 ℃、出口温度(85±5)℃、进料速率540～630 mL/h、空气流速600 L/h条件下喷雾干燥，获得鱼油微胶囊粉末。
将白藜芦醇溶解于70%乙醇中，配制质量浓度为50.5 mg/mL的白藜芦醇-乙醇溶液；添加白藜芦醇-乙醇溶液至TG-WPI溶液中，并加入一定量超纯水，于500 r/min下搅拌0.5 h，获得WPI和白藜芦醇摩尔比为1∶1的溶液；然后，制备鱼油和白藜芦醇共包埋乳状液，最终乳状液中含0.19%(质量分数)白藜芦醇，再喷雾干燥制备得到鱼油和白藜芦醇共包埋微胶囊粉末。
1.3.2 凝固型酸奶的制备
将5%白砂糖加入脱脂牛奶中，搅拌使其充分溶解。设置无添加的对照组，命名为Y；其余3组加入鱼油、鱼油微胶囊粉末或鱼油和白藜芦醇共包埋微胶囊粉末，分别命名为FY、FMY、FRMY，不同组酸奶组成如表1所示。搅拌待添加物完全溶解后于65 ℃水浴加热，并于20 MPa条件下均质15次；然后，将样品于95 ℃灭菌10 min，在室温环境待其温度降至40 ℃；添加酸奶发酵剂(0.04 g/L)，搅拌使其混匀，随后在40 ℃发酵，以pH=4.6判断发酵终点，置于4 ℃冰箱后熟。制得的酸奶在4 ℃冰箱贮存21 d，测定其指标变化。
表1 酸奶组成
Table 1 Composition of yogurt
样品添加物含量/[g·(100g)-1牛奶]Y无0 FY鱼油1.56 FMY鱼油微胶囊粉末4.68FRMY鱼油和白藜芦醇共包埋微胶囊粉末4.68
1.3.3 酸奶感官评价
参考王富云等[10]的方法并作一定修改，由10名经过培训的感评人员(5男5女)按照表2酸奶感官评价标准对各组酸奶的色泽、气味、滋味、质构和总体接受度进行评价。
表2 酸奶感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation of yogurt
项目标准得分/分呈乳白色,有光泽7～9色泽 稍呈黄色,有光泽4～6呈灰色,颜色暗淡1～3具有酸奶的特有香气,没有鱼油腥味7～9气味 稍有酸奶的特有香气,略有鱼油腥味4～6有明显鱼油腥味,掩盖了酸奶的特有香气1～3口感细腻,酸甜适中,无腥味7～9滋味 口感较细腻,酸甜适中,有轻微腥味4～6口感不细腻,过酸或过甜,有强烈腥味1～3无乳清析出、均匀细腻7～9质构 有轻微乳清析出、均匀细腻4～6大量乳清析出、明显分层1～3非常喜欢7～9总体接受度比较喜欢4～6不喜欢1～3
1.3.4 酸奶乳酸菌数的测定
参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定酸奶中乳酸菌数。
1.3.5 酸奶pH的测定
利用pH计测定各组酸奶在4 ℃贮存期间pH的变化情况。
1.3.6 酸奶持水力的测定
称取5 g酸奶于50 mL离心管中，于4 ℃、5 000×g条件下离心5 min，取其上清液称重。根据公式(1)计算酸奶持水力：
持水力
(1)
式中：m为酸奶质量；m1为离心后上清液的质量。
1.3.7 酸奶中功能因子稳定性的测定
称取5 g酸奶，搅拌均匀后测定贮藏期间白藜芦醇、DHA和EPA保留率。根据公式(2)计算4 ℃贮藏期间白藜芦醇的保留率：
保留率
(2)
式中：c0为第1天酸奶中白藜芦醇的含量；cn为第n天酸奶中白藜芦醇的含量。
1.3.7.1 酸奶中白藜芦醇的测定
参考ZHANG等[11]的方法，取一定量酸奶，加入4 mL甲醇后涡旋1 min，并于4 ℃、10 000×g条件下离心10 min，取其上清液测定在306 nm处吸光度，代入标准曲线计算白藜芦醇含量。
1.3.7.2 酸奶中EPA、DHA的测定
参考王彩霞[12]的方法，在酸奶中加入1 mL乙醇，再加入5 mL正己烷，于10 000 r/min下剪切1 min、涡旋3 min，于4 ℃、5 000×g离心5 min后移取2 mL上层液体至具塞试管中，氮吹仪除去有机试剂，提取鱼油。
鱼油甲酯化：添加2 mL 0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液至含鱼油的具塞试管中，涡旋1 min后于65 ℃ 水浴加热30 min；加入2 mL三氟化硼-甲醇溶液，于70 ℃加热30 min。然后，将具塞试管冷却，加入2 mL正己烷并涡旋30 s，加入4 mL饱和NaCl溶液，吸取上层有机液并加入少量无水硫酸钠后，取清液过有机相滤膜。
气相色谱分析：色谱柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样体积为1 μL，气化室温度为250 ℃，色谱柱流量1.0 mL/min，N2吹扫流量3 mL/min，分流比为10∶1；色谱柱温度为50 ℃；升温程序：初始温度为50 ℃，持续1 min，以25 ℃/min的升温速率升至200 ℃，再以3 ℃/min 的升温速率升至230 ℃，持续23 min；检测器温度为250 ℃；尾吹气为氮气(30 mL/min)，氢气(40 mL/min)，空气(400 mL/min)。
1.3.8 酸奶中油脂氧化的测定
参考KLINKESORN等[13]的方法并做一定修改。在酸奶中加入1.5 mL异辛烷/异丙醇(体积比3∶1，)混合液，涡旋30 s后于3 000×g条件下离心5 min提取氢过氧化物。取0.2 mL上层有机相，添加到2.8 mL 甲醇/正丁醇(体积比2∶1)混合液中，再加入15 μL硫氰酸铵溶液(3.94 mol/L)和15 μL亚铁离子溶液(在酸性溶液中将0.132 mol/L氯化钡溶液和0.144 mol/L硫酸亚铁溶液以体积比为1∶1混合得到)，涡旋30 s后避光反应20 min，测定510 nm处吸光度，通过过氧化氢异丙苯标准曲线确定氢过氧化物浓度。
1.4 数据处理
实验结果以平均值±标准偏差表示；采用SPSS 20.0软件进行单因素ANOVA分析，P<0.05说明数据之间存在显著性差异；使用Origin 9.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 感官评价
世界卫生组织和联合国粮农组织推荐的DHA和EPA每日摄入量为250～2 000 mg，参考此摄入量，添加鱼油及微胶囊粉末至酸奶中，制得的酸奶外观形态如图1所示，4组酸奶均为凝固状，其中对照组酸奶颜色呈乳白色，色泽均匀，但有少许乳清析出；而添加鱼油及微胶囊粉末组酸奶颜色偏黄，表面光滑，凝乳细腻且无明显乳清析出。对贮藏前后的酸奶进行感官评定，评价结果如图2所示。由图2-a可知，鱼油本身特有的鱼腥味会对酸奶的气味、滋味造成不良影响，使得FY组酸奶的可接受程度明显下降。微胶囊化可以掩盖鱼油的鱼腥味，FMY及FRMY组酸奶的气味、滋味均明显优于FY组酸奶，这与JAMSHIDI等[14]所获得的结果一致。此外，微胶囊粉末的加入使得酸奶的质构有所改善，FMY及FRMY组酸奶均匀细腻且无乳清析出，总体接受度也明显优于FY组酸奶，ZHONG等[15]同样发现添加鱼油/谷维素纳米乳液强化酸奶可以改善酸奶的质地。在4 ℃条件下贮藏21 d后，Y组酸奶的气味及滋味评分有所下降；直接添加鱼油的FY组酸奶所有指标评分都相对较低；FMY及FMRY组酸奶的气味及滋味评分未发生明显变化，且贮藏后仍能保持较好的质构特性，无明显乳清析出。由此可见，乳清蛋白微胶囊粉末可以作为酸奶稳定剂，有效防止贮藏期间鱼腥味的加重。然而，微胶囊化不能完全掩盖鱼腥味，导致贮藏后酸奶总体接受度有所下降，该情况还有待进一步改善。
图1 酸奶外观形态图
Fig.1 Appearance of yogurt
a-贮藏前酸奶；b-贮藏后酸奶
图2 酸奶贮藏前后感官评定结果
Fig.2 Sensory evaluation of yogurt before and after storage
2.2 乳酸菌数
保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌是酸奶发酵过程中常用的乳酸菌菌种，具有产酸增黏作用，对于酸奶的风味及质地具有重要影响，一般认为酸奶乳酸菌总数达106 CFU/g以上才能保证足够的益生活性[16]。由表3、表4可以看出，随着贮藏时间的延长，4组酸奶的保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌菌数均有所减少，但贮藏期间其乳酸菌菌落数均高于106 CFU/g。鱼油及微胶囊粉末的加入对于酸奶乳酸菌数无明显影响，说明鱼油及微胶囊粉末对乳酸菌没有抑制作用。FENG等[17]也发现加入虾青素微胶囊的酸奶其乳酸菌数与原味酸奶无明显差异，而在酸奶中添加茴香油同样不会对乳酸菌活性产生显著影响。
表3 贮藏期间酸奶的保加利亚乳杆菌菌落数
Table 3 Lactobacillus bulgaricus activity of
yogurt during storage
样品保加利亚乳杆菌×10-8/(CFU·g-1)7 d14 d21 dY2.68±0.45Aa0.92±0.23Ba0.76±0.11BaFY2.76±0.11Aa1.06±0.25Ba0.72±0.06CaFMY2.72±0.17Aa1.04±0.17Ba0.72±0.17CaFRMY2.92±0.34Aa1.06±0.25Ba0.78±0.03Ba
注：大写字母代表不同时间，小写字母代表不同样品；不同字母代表存在显著性差异(P<0.05)(下同)
表4 贮藏期间酸奶的嗜热链球菌菌落数
Table 4 Streptococcus thermophilus activity of
yogurt during storage
样品嗜热链球菌×10-8/(CFU·g-1)7 d14 d21 dY2.72±0.79Aa1.02±0.20Ba0.84±0.11BaFY2.90±0.25Aa1.16±0.28Ba0.92±0.23BaFMY2.84±0.40Aa1.04±0.11Ba0.86±0.14BaFRMY3.06±0.48Aa1.08±0.34Ba0.94±0.20Ba
2.3 pH
pH会对酸奶的风味及口感产生一定影响，贮藏期间酸奶的pH变化情况如表5所示。随着贮藏时间的延长，4组酸奶的pH均呈现逐渐下降的趋势，其中Y组及FY组酸奶pH下降趋势一致，而FMY组及FRMY组酸奶pH变化趋势相同。酸奶pH的降低是乳酸菌发酵使得乳糖分解产生乳酸所导致的，贮藏前期乳酸菌代谢活性相对较强，因而酸奶pH降低较快，而贮藏后期乳酸菌代谢减弱，因而pH无明显变化[18]。贮藏21 d后，各组酸奶pH均降至4.2左右，鱼油及微胶囊粉末的加入并未显著影响酸性物质的产生。ABEDI等[19]同样发现贮藏4周后添加黑种草籽油微胶囊的营养强化型酸奶和对照组酸奶pH没有显著差异。
表5 贮藏期间酸奶的pH值
Table 5 pH of yogurt during storage
样品1 d7 d14 d21 dY4.44±0.07Aa4.34±0.07Aa4.22±0.05Ba4.19±0.07BaFY4.61±0.11Ab4.49±0.10Ab4.28±0.02Bb4.23±0.02BaFMY4.54±0.06Aab4.38±0.06Bab4.26±0.01Cab4.23±0.04CaFRMY4.55±0.07Aab4.35±0.04Ba4.26±0.00Cab4.23±0.02Ca
2.4 持水力
酸奶持水力是指凝固型酸奶持有全部或部分自身水的能力，是衡量酸奶稳定性的重要指标之一。表6为贮藏期间酸奶的持水力变化情况，由表6可知，4种凝固型酸奶的持水力在贮藏期间均无明显变化，其中Y组酸奶持水力相对较低，酸奶三维凝胶网络结构稳定性相对较差。鱼油加入后，可以与酪蛋白相互作用形成凝胶网络，使得FY组酸奶持水力有所提高[20]。而FMY及FRMY组酸奶的持水力显著高于FY及Y组，可见微胶囊粉末的加入有利于提高酸奶持水力，防止贮藏期间乳清的析出，孙亚利[21]也发现添加苦荞黄酮提取物微胶囊的酸奶持水力优于普通酸奶。付丽等[22]同样发现乳清蛋白粉的加入可以明显提升酸奶持水力。这可能是由于乳清蛋白与酪蛋白相互作用，形成蛋白质均匀多孔网状结构，使得蛋白与水的结合能力有所增强，从而可以防止乳清的析出。
表6 贮藏期间酸奶的持水力
Table 6 Water holding capacity of yogurt during storage
样品1 d7 d14 d21 dY52.05±11.27Aa49.13±0.82Aa42.23±6.63Aa44.70±3.20AaFY55.11±0.13Aa53.60±0.51Aa55.38±4.88Ab54.21±2.73AbFMY78.35±7.84Ab78.78±7.99Ab82.90±3.80Ac82.83±4.25AcFRMY78.75±6.85Ab78.92±7.34Ab78.02±5.42Ac78.91±3.50Ac
2.5 功能因子稳定性
鱼油富含多不饱和脂肪酸，其中EPA可以增强机体免疫功能、降低胆固醇水平、预防和治疗动脉硬化等心血管疾病，DHA则具有促进大脑发育、提高记忆力、保护肝脏和改善视力等作用。图3-a、图3-b分别为4 ℃ 贮藏期间酸奶中EPA、DHA保留率。贮藏期间FY、FMY及FRMY组酸奶中EPA及DHA含量均呈现下降趋势，直接添加鱼油的FY组酸奶中EPA、DHA保留率明显降低，贮藏21 d后剩余55.54% EPA和52.50% DHA。而FMY组酸奶EPA、DHA保留率均明显高于FY组酸奶，分别为64.42%和63.47%。FRMY组酸奶EPA、DHA保留率则与FMY组接近，分别为70.59%和69.34%，白藜芦醇的加入没有显著影响酸奶中EPA和DHA的保留率。并且，酸性条件有利于延缓白藜芦醇的降解[23]。由图3-c可知，贮藏期间白藜芦醇保留率随时间延长有所下降，但贮藏结束后，FRMY组酸奶中仍能保留约80%白藜芦醇。DE MOURA等[24]添加玫瑰茄花青素微粒于酸奶中，发现在贮藏后其酚类化合物含量高于直接添加游离提取物的酸奶。
a-EPA保留率；b-DHA保留率；c-白藜芦醇保留率
图3 贮藏期间FY、FMY和FRMY组酸奶中EPA、DHA保留率及FRMY组酸奶中白藜芦醇保留率
Fig.3 Retention of EPA, DHA in FY, FMY and FRMY yogurts and of resveratrol in FRMY yogurt during storage
注：大写字母代表不同时间，小写字母代表不同样品；不同字母代表存在显著性差异(P<0.05)(下同)
2.6 油脂氧化
由于鱼油含有高不饱和双键，因此在加工和贮藏过程中极易发生氧化，导致酸败及异味的产生。图4为FY、FMY及FRMY组酸奶在4 ℃贮藏期间氢过氧化物值的变化情况。贮藏1 d后，FY组酸奶的氢过氧化物值(0.61 mmol/g油)略高于FMY及FRMY组酸奶。贮藏过程中，3组酸奶的氢过氧化物值均呈现逐渐增大的趋势。贮藏21 d后，添加2种微胶囊粉末的酸奶，其氧化程度均低于鱼油组酸奶，说明微胶囊化有利于提高鱼油的氧化稳定性。TAMJIDI等[18]同样发现利用明胶/阿拉伯胶包埋鱼油可以有效防止油脂的氧化。此外，贮藏结束后FRMY组酸奶的氢过氧化物值明显低于FMY组酸奶，这表明白藜芦醇的加入可以进一步抑制鱼油的氧化。
图4 贮藏期间FY、FMY和FRMY组酸奶氢过氧化物值
Fig.4 Hydroperoxide value in FY, FMY and
FRMY yogurts during storage
3 结论
利用基于乳清蛋白的微胶囊粉末对鱼油进行包埋和保护有利于掩盖其固有鱼腥味，提高酸奶的可接受程度。微胶囊粉末的加入能够提高酸奶持水力，改善酸奶的质构，防止贮藏期间乳清的析出。贮藏期间，酸奶乳酸菌数及pH均呈现下降趋势，但微胶囊粉末的加入对于酸奶乳酸菌数及酸性物质的产生没有显著影响。添加鱼油和白藜芦醇共包埋微胶囊粉末可以提高酸奶的营养价值，酸奶于4 ℃贮藏21 d后仍可保留70.59% EPA、69.34% DHA以及81.06%白藜芦醇，可见微胶囊化对于功能因子有较好的保护效果。此外，微胶囊化显著提高了鱼油的氧化稳定性，白藜芦醇的加入有利于进一步抑制鱼油氧化。共包埋以及微胶囊化有利于实现鱼油、白藜芦醇等低水溶性功能因子在酸奶行业的应用，具有良好的发展前景及巨大的市场潜力。
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