不同品种花生红衣中八种酚类物质成分分析

花生，一年生豆科草本植物[1]，是重要的高蛋白油料作物之一。我国是世界花生生产大国，2019年产量约1 752万t。花生红衣作为花生加工副产物之一，资源丰富，年产量约45万t(按花生总质量的2.6%计[2])。目前，除少量花生红衣应用于制药及食品加工[3]，大多用于饲料或被舍弃，其商业价值十分低廉，仅约70 ～120元/t，在很大程度上造成资源浪费。

花生红衣含有丰富的营养成分，除含有约37%～42%的纤维素、10%～14%的脂肪和11%～17%的蛋白外，还含有约15%的酚类物质[4]。花生红衣中含有的酚类物质具有降血糖、清除自由基、促进血小板生成、降血脂及抑菌等多种生理功能[5]。CHRISTMAN等[6]通过体内外试验研究发现花生红衣多酚提取物具有降血糖功效；赵萍等[7]的研究表明花生红衣多酚提取物对DPPH自由基具有较好的清除能力；刘婧依等[8]探讨了升血小板胶囊联合花生衣提取液治疗特发性血小板减少性紫癜患者的临床效果，结果表明血小板数目高于对照组。为充分利用花生红衣中的酚类物质，国内外学者对花生红衣的提取方法开展了诸多研究，目前采用的主要方法包括溶剂提取、超声波辅助提取及微波辅助提取[9]。

研究发现，花生红衣酚类提取物的活性强弱受其酚类物质的组成和含量的影响[10-11],而花生红衣中酚类物质的组成和含量又受到花生品种等因素的影响，例如，宋昱等[10]对3个不同花生品种的花生衣中的原花青素进行了检测分析，发现花生衣原花青素组分的单体种类及含量均不同；张姣勤[11]对8个不同花生品种中的多酚含量进行测定，结果可大致分为3组，含量分别为190、160、130 mg/g，总酚含量具有较大差异，且不同单酚间也具有明显差异，但单酚含量未进行定量分析。因此分析不同品种间花生红衣中的酚类物质组成和含量，掌握花生红衣酚类物质的组成变化规律，对于花生红衣制药及功能性花生红衣食品的选材和质量控制尤为重要。目前，虽然国内外开展了花生红衣酚类成分分析的研究，但研究不系统，仅集中于总酚、某种酚类浓度检测，且未覆盖在不同花生品种中分布规律[12-15]。此外，现有的检测花生红衣酚类物质的主要方法为HPLC，由于花生红衣中的酚类物质组成复杂，不同酚类浓度相差悬殊，造成现有高效液相检测方法存在预处理繁琐，检测过程复杂，难以兼顾多种酚类检测等缺点，难以满足花生红衣酚类物质检测工作，有必要建立一种更加方便、准确、高效的适宜检测花生红衣中主要酚类物质高效液相方法。

因此，本文通过实验构建能够同时检测8种花生红衣中酚类的HPLC方法，通过分析40种花生红衣的酚类物质组成，利用相关性分析方法和聚类分析方法进行相关性分析和类群划分，以揭示花生红衣间8种酚类成分的含量特点、不同酚类成分之间的相关性及类群之间的差异性，为花生红衣的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：供试40个花生品种由河南绿色作物研究中心提供，具体花生品种如下：远杂9102(YZ9102)、花育23(HY23)、花育24(HY24)、鲁花11(LH11)、天府3号(TF3)、丰华(FH)、四粒红(SLH)、冀花2号(JH2)、二粒红(ELH)、白沙1016(BS1016)、冀花5号(JH5)、花育26(HY26)、大白沙(DBS)、拔二罐(BEG)、黑花生(HHS)、白沙(BS)、花育25号(HY25)、白沙308(BS308)、冀花4号(JH4)、国育2016(GY2016)、小白沙(XBS)、大果101(DG101)、豫花9414(YH9414)、大麻(DM)、商花5号(SH5)、鲁花14(LH14)、徐花13(XH13)、徐花14(XH14)、远杂9307(YZ9307)、青花6号(QH6)、花育16(HY16)、漯花8号(LH8)、豫花25(YH25)、花育37(HY37)、花育19(HY19)、丰花1号(FH1)、冀花20(JH20)、花育48(HY48)、花育42(HY42)、花育38(HY38)，其中HHS、GY2016为黑花生。花生经去红衣机分离并收集红衣，保存于-4 ℃冰箱中。

原儿茶素、表没食子酸儿茶素、儿茶素、咖啡酸、表儿茶酸、原花青素C1、阿魏酸、表儿茶素没食子酸酯和芦丁标准品(纯度≥98%)，北京世纪奥科生物技术有限公司；乙腈(色谱纯)，美国VBS公司；冰乙酸(HPLC≥99.9%)，阿拉丁；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪，美国赛默飞公司；XS205电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；T18DS25高速均质机，艾卡(广州)仪器设备有限公司；XH-2008DE智能温控双频超声波合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司；Lyovac GT1 型冷冻干燥机，德国SRK公司。

1.3 实验方法

HPLC色谱柱：X-Bridge shield RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温，30 ℃；进样量，10 μL；检测波长：250 nm(原儿茶酸、表没食子酸儿茶素)、280 nm(儿茶素、表儿茶素、原花青素C1、表儿茶素没食子酸酯)、320 nm(阿魏酸、咖啡酸)和370 nm(芦丁)；流动相A：0.1%乙酸-乙腈溶液，流动相B： 0.1%乙酸-水溶液；梯度洗脱：0～7 min(5% A～7% A，1 mL/min)； 7～30 min(7% A～10% A, 1 mL/min)；30～60 min(10% A～12% A，1 mL/min)；60～80 min(12% A～15% A，1 mL/min)；80～100 min(15% A～80% A, 1～0.9 mL/min )。

1.3.2 标准品溶液的制备

分别精确称取一定质量的原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、原花青素C1、阿魏酸、表儿茶素没食子酸酯和芦丁8种标准品，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，其中芦丁需加入少量二甲基亚砜助溶。随后配制成一系列浓度的混合标准溶液。将标准品溶液用0.45 μm微孔过滤膜过滤，用HPLC分析检测，并建立相对应的回归方程。

1.3.3 花生红衣中酚类物质的提取

1.3.3.1 超声波辅助提取[12]

以大果101为例，取适量花生红衣，置于粉碎机中，粉碎过60目筛，精确称取适量筛下物置于锥形瓶中，分别采取均质提取、超声提取和回流提取等提取方法，对不同提取溶剂、提取时间、料液比等因素做单因素试验探究酚类化合物的提取率，以提取率为主要指标，综合考虑提取方法，选择80%(体积分数)乙醇水溶液作为提取溶剂、料液比1∶30(g∶mL)、超声波辅助提取花生红衣中酚类物质，超声时间20 min，超声功率 300 W，超声温度40 ℃，超声提取后5 000 r/min 离心15 min，收集上清液，沉淀重复上述操作2次，合并3次花生红衣酚类化合物提取液，经减压浓缩、真空冷冻干燥，获得花生红衣酚类提取物。

1.3.3.2 供试样品的制备

将各花生品种的花生红衣酚类提取物保存于干燥器中备用。经考察溶剂、料液比、超声波辅助溶解时间等因素，选择甲醇为溶剂，称取0.1 g花生红衣酚类提取物，以料液比1∶50(g∶mL) 配制成溶液，超声辅助溶解20 min，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，既得供试样品，4 ℃保存备用。

1.3.3.3 花生红衣中酚类化合物的检测

将供试样品溶液经0.22 μm有机滤膜过滤后置于进样瓶中，用于HPLC检测。以标准溶液质量浓度(μg/mL)为纵坐标，以对应峰面积为横坐标，绘制标准曲线，并进行回归计算得到8种酚类化合物回归方程，检测供试样品中8种酚类物质的含量。每种酚类化合物分别以信噪比为3和10对应的酚类化合物标准品质量浓度计算检出限和定量限。

1.4 数据统计分析

所有数据均为3次重复实验的平均值，应用SPSS 16.0 和Origin 8.5对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 八种酚类标准品溶液和花生样品的HPLC检测结果

由图1-a可以看出，在此色谱条件下，8种酚类化合物的标准品可得到较好的分离。由图1-b可知，大果101花生红衣中除芦丁外，其余7种酚类物质均有检出，且目标峰的保留时间与标准品溶液的保留时间一致，在此色谱条件下花生红衣样品中的酚类化合可物得到较好的分离。

2.2 单酚标准曲线

在优化的实验条件下，将一系列混合标准品溶液进HPLC分析，以标准溶液质量浓度(μg/mL)为纵坐标，各酚类物质对应的峰面积为横坐标，绘制标准曲线，如表1所示，8种酚类物质在标准品质量浓度范围内均呈现良好的线性关系。

2.3 HPLC方法学考察

如表2所示，HPLC方法学考察结果显示，8种酚类物质的精密度相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.67%～1.96%，稳定性RSD为0.73%～2.31%，重复性RSD为1.85%～3.92%，平均回收率为94.15%～100.62%，RSD为0.86%～2.74%，表明仪器精密度良好，实验方法稳定性、重复性和加标回收率均符合常规定量分析要求，可以满足花生红衣中8种酚类物质的含量测定要求。且该HPLC方法与张姣勤[11]建立的花生红衣酚类HPLC检测方法相比，基线平稳，杂峰少；与刘翠[16]建立的HPLC方法相比，省去了固相微萃取柱的样品纯化，采用甲醇再溶解，既除去部分杂质，又提高供试样品浓度，降低检测成本；与RESURRECCION等[17]建立的检测方法相比，简化了样品的纯化步骤，减少了有毒试剂的使用，且降低了流动相的流速，对设备要求降低，更便于推广使用。

2.4 八种酚类物质的统计分析和热图分析

采用上述HPLC检测方法，对40种不同品种花生红衣中的8种酚类物质进行检测，为了直观系统地表明各品种间中不同酚类物质的变化情况，通过描述性分析对于40种不同品种花生红衣中的酚类物质进行了综合表述。由表3可知，40种不同品种花生红衣的8种酚类物质的总含量平均值为1.692 mg/g，且各个品种间酚类物质总含量存在差异，介于0.901～3.390 mg/g。8种酚类物质在不同品种的花生红衣中存在差异性，变异系数介于0.447～4.783，其中芦丁的变异系数最大为4.783，其次为表儿茶酸和咖啡酸分别为2.950和0.892，研究结果与张姣勤[11]、刘翠[16]、RESURRECCION等[17]的研究结果一致。8种酚类物质中，原花青素C1在花生红衣中的平均含量最高为0.729 mg/g，含量分布为0.141～1.947 mg/g，其次为儿茶素平均含量0.406 mg/g，含量分布为0.181～1.120 mg/g，分别占8种酚类总含量的43.08%和24.00%，平均含量较低的酚类物质为咖啡酸、表儿茶酸和芦丁，咖啡酸含量为0.000～0.063 mg/g，平均值为0.021 mg/g，表儿茶酸含量为0.000～0.530 mg/g，平均值为0.034 mg/g，芦丁含量为0.000～4.783 mg/g，平均值为0.034 mg/g，其仅在HHS和GY2016中检出，且二者均为黑花生。

为了更为直观地表述40种酚类物质中测得的8种酚类物质的具体分布情况，采用近年来被广泛应用的热图分析方法对结果进行分析，如图2所示，热图中颜色越接近蓝色，表示相对值越高，越接近红色，表示相对值越低。研究表明，原花青素C1是表儿茶素三聚体，具有抗癌、降糖等功效，尤其是在抗黑色素肿瘤方面效果明显[18]；儿茶素为花生红衣中有效的止血成分，且具有抗氧化、抗癌及抑菌作用[19]；表儿茶素没食子酸酯是一种儿茶素单体，具有抗癌、抑菌等药理活性[20]；且阿魏酸、原儿茶酸、表儿茶酸、芦丁及咖啡酸，也具有抗病毒、神经保护、消炎等多种生理功能[21-24]。因此，花生红衣中酚类物质的种类及含量丰富，且这些酚类物质均具备多种生理活性功能，表明花生红衣具备开发功能性大健康食品的潜质。

2.5 相关性分析

花生红衣中8种酚类化合物的相关性如表4所示，原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯与原花青素C1、儿茶素与咖啡酸均呈现极显著正相关(r=0.432，r=0.510，r=0.404，r=0.445，P<0.01)，原儿茶酸与表儿茶素没食子酸酯呈现显著正相关(r=0.392，P<0.05)。阿魏酸与原儿茶酸、原花青素C1及表儿茶素没食子酸酯均呈现极显著负相关(r=-0.538，r=-0.597，r=-0.502，P<0.01)，其余酚类化合物之间无显著相关性。该研究结果可能与这些酚类物质生物合成及代谢通路有关，通过KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)代谢途径对8种酚类化合物原儿茶酸(C00230)、儿茶素(C06562)、咖啡酸(C01197)、表儿茶酸(C09727)、阿魏酸(C01494)、表儿茶素没食子酸脂(C09731)、芦丁(C06801)及原花青素C1(C17642)所涉及的代谢通路查询可知，它们涉及的代谢通路包括12条，其中苯丙素的生物合成(map 01061)包含这些物质的种类最多为6种(图3)。由图3可知，苯丙素类化合物的生物合成的经糖酵解生成 (-)-3-去氢莽草酸， (-)-3-去氢莽草酸生成原儿茶酸与莽草酸酯，莽草酸酯经酶的反应生成对香豆酸，对香豆酸可合成咖啡酸、阿魏酸，并最终形成木脂素化合物，同时，也参与合成柚皮素查耳酮，随后形成表儿茶素、儿茶素，延伸为原花青素C1，最终聚合为高聚花青素。阿魏酸与原儿茶酸、原花青素C1属于代谢通路中的不同分支，存在竞争性关系，这与阿魏酸同原儿茶酸、原花青素C1呈现极显著负相关的结果相一致；而原花青素C1为儿茶素及表儿茶素的延伸单位，和儿茶素与原花青素C1呈现极显著正相关的结果相一致。物质在生物体内的合成代谢过程是复杂，且受环境(外部因素)与基因(内部因素)的调控，因此原儿茶酸与原花青素C1及儿茶素与咖啡酸的相关性与该代谢通路中呈现的关系相矛盾，这一结果可能与它们参与的其他生物代谢通路有关，后续仍需进一步验证。

2.6 聚类分析

以欧氏距离和最长距离法对40个花生红衣品种进行聚类分析[25]，如表5和图4所示，当欧氏距离为5时，可将40个品种分成三类群。其中A群包括16个样品，占总样品的40.0%，该类群中芦丁的含量均值高于B群和C群，为0.085 mg/g。B群包括17个样品，占总样品数的42.5%，该类群中儿茶素、原儿茶素C1的含量均值均高于A群和C群，分别为0.350、0.787 mg/g。C群包括7个样品，占总样品数的17.5%，其原儿茶酸、咖啡酸、表儿茶酸、表儿茶酸没食子酸酯和阿魏酸的含量均值在三类群中均为最高，分别为0.188、0.306、0.830、0.278、0.247 mg/g。

综上所述，3个类群具有不同的加工适用性，其中，A类群可用于芦丁和阿魏酸开发利用的首选资源，B类群适用于儿茶素、原儿茶素C1、表儿茶素没食子酸酯的开发利用，C类群可用于原儿茶素、咖啡酸、表儿茶酸、表儿茶酸没食子酸酯和阿魏酸的开发利用，且8种酚类物质总含量最高。花生红衣中酚类物质的含量可能与花生品种、产地有关[10-11,17]，聚类分析较好地体现了不同品种间花生红衣酚类物质的差异性，为花生红衣营养价值及药用开发提供了一定的数据和理论支撑。

3 结论

本研究建立了HPLC同时检测花生红衣中8种酚类物质的检测方法，经验证该方法重复性好、精密度高、稳定性好、加标回收结果准确可靠，可在100 min内对8种酚类物质进行有效分离，峰形对称、分离度高。通过对40个不同品种花生红衣中8种酚类物质的检测分析表明，8种酚类物质在不同品种中的组成及含量均存在差异；不同酚类物质间表现出一定的相关性；聚类分析可将40个资源划分为三类。

酚类物质作为花生红衣的主要活性成分，其各组分的组成和含量对于花生红衣的功能性质起着决定性作用，因此，建立合理高效的检测方法，对不同品种的花生红衣酚类成分进行综合分析评价，对于花生及花生红衣品种的选育、资源开发利用提供依据具有重要的研究意义，但花生红衣中的酚类物质成分复杂多样，尽管本研究已实现8种酚类物质的同时检测，但仍然具有一定的局限性，有待进一步深入研究。

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