肠出血性大肠杆菌O157∶H7(Enterohemorrhagic Escherichia coli 157∶H7, EHEC O157)是全球范围内食物中毒及引发传染病重要原因之一，可引发出血性结肠炎(hemorrhagic enteritis，HC)、溶血性尿毒综合症(heomlytic uremic syndrome，HUS)以及血小板减少性紫癜(thrombocytopenia purpura，TTP)等严重病症，它能够产生大量的毒力因子，增强宿主定殖能力，使其菌体可以快速地定殖并且在表面进行传播[1-3]。由于EHEC O157病情凶险且死亡率高，已引起各国政府、世界卫生组织以及研机机构的高度重视，成为全球性的公共卫生问题[4-5]。
肉桂精油(cinnamon essential oil)其主成分为肉桂醛、反式肉桂醛、萜品烯、β-榄香烯等，这些成分具有良好的抗菌效果。许国娟等[6]研究表明将肉桂醛封装在水包油纳米乳液中，发现制备的纳米乳剂对指状青霉有抑制作用，对柑橘类水果采后的货架期也有影响；崔乔等[7]以肉桂醛为研究对象添加在羔羊饲料中，研究发现饲粮中添加适量的肉桂醛在羔羊生产中具有积极的意义，可以提高平均日增重，降低料重比，促进饲粮营养物质的消化利用以及羔羊瘤胃中瘤胃微生物蛋白的合成，并可提高羔羊对能量及氮的利用率。有研究表明山苍子精油或柠檬醛与其他食用精油结合使用，制备得到的复合油可以对新鲜肉制品以及果蔬起到很好的防腐保鲜效果[8-10]。
本研究拟以探究肉桂精油对EHEC O157的呼吸作用的影响，初步明确肉桂精油的作用位点，希望可以减少由EHEC O157引起的卫生安全事件，同时为天然抗菌剂的开发提供部分有效的理论依据[11-12]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
肉桂精油购于上海源叶生物公司;EHEC O157取自甘肃省疾控中心。
1.2 试验试剂
无水乙醇、胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)、LB肉汤、LB琼脂、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、吐温-80、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、β-巯基乙醇、正十六烷(均为分析纯)、BCA法蛋白含量测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量试剂盒、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性检测试剂盒，上海优选生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器，上海申安有限公司；THZ-83A水浴恒温振荡器，金坛市江南仪器厂；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；H-1850R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计，日本Shimadzu公司；SCIENTZ-10 ND恒温搅拌水浴锅，宁波新芝冻干设备股份有限公司；FA1004分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；雷磁PHS-25型PH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 肉桂精油主要化学组分和含量
因为肉桂种植广泛且精油提取方式众多，不同来源的肉桂在主要组成成分上存在一定差异。因此在对肉桂精油对EHEC O157的抗菌活性及抗菌机制进行研究前，本课题对试验所用肉桂精油主要组分进行了分离鉴定。
1.4.2 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小抑菌圈
本试验采用双层琼脂孔穴扩散法[13]测定肉桂精油对EHEC O157的MIC，以EHEC O157为靶标菌，将靶标菌接种到LB液体培养基中，37 ℃振动培养24 h，使菌悬液浓度达到OD600=2.0，备用。将灭菌过的LB固体培养基15 mL倾倒至灭菌过干燥的培养皿中，等凝固形成底层并放置无菌牛津杯，吸取200 μL的靶标菌液加入温度不烫手且未凝固的无菌LB固体培养基中，振荡摇匀，倾倒25 mL至平皿中，待凝固形成上层，取出牛津杯形成有孔穴的培养平板，在已形成的孔穴中加入肉桂精油。将培养平板至于37 ℃的培养箱中恒温培养24 h，观察肉桂精油的抑菌效果。
1.4.3 细胞内核酸与蛋白质的泄漏
参照HUANG等[14]的测定方法，对肉桂精油处理后的细胞内大分子物质泄漏进行测定。取处于生长对数期的EHEC O157，6 000 r/min离心10 min，菌体沉淀用无菌PBS进行清洗3次以上，得到干净的菌体沉淀,用无菌PBS(0.03 mol/L，pH 7.2)重悬至OD600=0.8。肉桂精油用无水乙醇溶解，加入菌悬液中使肉桂精油质量浓度梯度分别为0.000 2、0.000 4、0.000 8 g/L，添加等量无水乙醇作为空白对照，37 ℃恒温振荡培养，期间每隔2 h分别测1次OD260nm值和OD280nm值。
1.4.4 BCA法蛋白定量测试盒测定蛋白含量
采用BCA法蛋白定量测试盒进行蛋白含量的测定[15]。取处于对数生长期的EHEC O157菌液5 mL，4 000 r/min离心10 min，菌体沉淀用无菌PBS进行清洗，得到的菌体沉淀重悬于无菌LB培养基中，使菌体浓度达到OD600nm=2.0。将重悬后的菌悬液分为2组，试验组肉桂精油用无水乙醇溶解，加入菌悬液中使肉桂精油浓度梯度分别为1/2MIC、MIC，对照组加入无水乙醇，所有样品在37 ℃培养4 h。取1 mL菌悬液，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，沉淀用无菌PBS清洗3次以上，得到的菌体沉淀重悬于无菌PBS中，冰浴破胞(300 W，10 min，间隔1.1 s)待测。根据BCA蛋白定量测试盒方法，用酶标仪在526 nm处测吸光度值并记录。
1.4.5 碱性蛋白酶活性测定[16]
参照碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)试剂盒的方法，菌体前处理与蛋白定量测定相同，菌悬液培养4 h后，4 ℃ 6 000 r/min离心10 min去上清液，得到的下层沉淀细胞悬于500 μL热双蒸水中，置于沸水浴中10 min加热破胞，将上述处理好的菌悬液用涡旋振荡器充分混匀。根据AKP试剂盒的方法，用酶标仪在520 nm处测吸光度值并记录。AKP存在细菌壁和细胞膜之间，如果其活性受到抑制，可以间接地证明细胞壁受损伤。
1.4.6 SDH活性测定[17]
参照SDH活性试剂盒的方法，菌体前处理与碱性蛋白酶测定处理方法相同，各组样品经过超声破胞后，最后按照试剂盒上的方法，用酶标仪在600 nm处测吸光度值并记录。
1.5 数据处理与分析
使用IBM SPSS Statistics 22和Origin 2018软件对实验数据进行统计学处理与作图分析，误差线表示为平均值±标准差(SD)。所有试验均重复3次取平均值。
2 结果与分析
2.1 肉桂精油主要化学组分及含量
肉桂精油进行GC-MS分析，对前7种化合物进行了鉴定(表1)，这7种化合物包含醛类(肉桂醛50.17%，枯茗醛1.238%)；烯类[(-)-α-荜橙茄油烯16.57%，β-榄香烯9.39%，α-衣兰油烯5.22%，(+)-环苜蓿烯2.11%]以及酚类化合物(小茴香酚1.61%)，占肉桂精油总成分的86.308%。在肉桂精油组分中占比最大的是肉桂醛，已被证明具有较强的抗菌活性，在食品及医学等领域具有广泛的应用。除此之外，研究发现烯类化合物可以改变细胞表面电荷[18]，抑制微生物的生长。因此可以推测肉桂精油的抗菌活性来源于多种组分之间的协同抗菌，对阐明其抗菌机制具有重要意义[18]。
表1 肉桂精油主要化学组分及含量
Table 1 Main chemical components and
contents of cinnamon essential oil
序号成分CAS号含量/%1肉桂醛104-55-250.172(-)-α-荜橙茄油烯14699-14-816.573β-榄香烯515-13-99.394α-衣兰油烯10208-80-75.225(+)-环苜蓿烯22469-52-92.116小茴香酚73365-77-21.617枯茗醛122-03-021.238
2.2 MIC和最小抑菌圈
肉桂精油对EHEC O157的生长有影响，如图1所示，其中A为空白对照组，B为肉桂精油处理组，从图1-B可看出肉桂精油对EHEC O157有一定的抑制作用，通过测量可知所形成的抑菌圈的最小直径为20 mm，相对应肉桂精油的MIC值为0.000 4 g/L。
A-CK组；B-处理组
图1 肉桂精油对EHEC O157的抑制作用
Fig.1 Inhibition of cinnamon essential oil on EHEC O157
2.3 EHEC O157胞内大分子物质泄露的分析
由图2可知，肉桂精油处理组的OD260nm和OD280nm值均显著增大，这说明肉桂精油会影响EHEC O157细胞膜通透性，致使胞内大分子核酸和蛋白质泄漏，与空白组对比，1/2MIC浓度的肉桂精油处理2 h后，核酸泄漏量(OD260nm值)和蛋白质泄漏(OD280nm值)分别提高了3.88、1.25倍。核酸及蛋白质的泄漏量都与精油的添加量呈正相关，并且随着精油添加量的增加，OD260nm值和OD280nm值都明显增大。当肉桂精油处理菌液至8 h时，对照空白组，3个不同浓度处理组(1/2MIC、MIC、2MIC)，核酸泄漏量分别增加了1.87、3.1.3、3.67倍；蛋白质泄漏分别增加了1.41、2.10、2.57倍。进一步证明，当肉桂精油处理EHEC O157时，能够作用于细胞膜，从而破坏EHEC O157细胞内环境的稳定，导致胞内大分子物质核酸和蛋白质的泄漏，最终引起菌体衰败死亡[19]。
A-核酸；B-蛋白质
图2 肉桂精油对EHEC O157胞内大分子
物质泄漏的影响
Fig.2 Effects of cinnamon essential oil on intracellular
macromolecule leakage of EHEC O157
2.4 肉桂精油对EHEC O157蛋白合成能力的影响
蛋白质是菌体维持正常生命活动所需的必要物质基础，如果菌体合成蛋白的能力受到抑制，就会影响正常生命代谢活动，最终会导致菌体的衰败死亡。如图3所示，随着肉桂精油浓度的增加和处理时间的延长，菌体合成蛋白的能力受到比较明显的抑制，例如，当精油浓度为1/2MIC且处理时长到4 h时，对照空白组，菌液中蛋白的含量下降为(1.07±0.02)μg/mL，与此同时，MIC处理组菌液中蛋白质含量下降为(0.68±0.02)μg/mL。这可以证明，经过肉桂精油处理的EHEC O157胞内可溶性蛋白的含量会降低。因此，肉桂精油能够影响EHEC O157蛋白质合成能力，从而抑制菌体生长[20]。
图3 肉桂精油对EHEC O157蛋白合成能力的影响
Fig.3 Effects of cinnamon essential oil on EHEC O157
protein synthesis
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.5 肉桂精油对AKP活性的影响
大肠菌属的AKP是非特异性的磷酸单酯酶，可以催化磷酸单酯水解为磷酸、醇和酚类等化合物，存在于细菌的细胞壁和细胞膜之间，若菌体细胞壁遭到破坏，AKP的活性也会相应的受到抑制[21]。如图4所示，精油孵育4 h后，随着菌体生长，空白组AKP的活性增加了2.159倍；而当菌体受到肉桂精油处理后，孵育4 h后，1/2MIC和MIC组的AKP的活性变为77.23%和52.07%，这说明菌体胞内酶碱性磷酸酶AKP活性受到了一定程度的抑制。
图4 肉桂精油对EHEC O157 AKP活性的影响
Fig.4 Effects of cinnamon essential oil on EHEC
O157 AKP enzyme activity
2.6 肉桂精油对SDH活性的影响
SDH，是三羧酸 (tricarboxylic acid, TCA)循环中唯一一个整合在细胞膜上的多亚基酶。在TCA循环中，为线粒体需氧和产能提供电子，是线粒体的一种标志酶[22]。如图5所示，在肉桂精油浓度从0增加至3/8MIC，菌液可检测到SDH活性明显呈上升趋势，并在肉桂精油浓度为3/8MIC时达到峰值，此后，随着肉桂精油浓度的增加，SDH在菌液中的活性逐渐降低，当精油浓度达到MIC时，菌液中可测到的SDH活性相对于最高活性降低了65.3%。这说明肉桂精油对EHEC O157的呼吸作用有一定的抑制作用，能够破坏菌体正常的TCA循环，中断部分呼吸链的电子传递。
图5 肉桂精油对EHEC O157 SDH活性的影响
Fig.5 Effects of cinnamon essential oil on EHEC O157
SDH activity
3 结论
研究显示，肉桂精油对EHEC O157 MIC为0.000 4 g/L。肉桂精油能明显抑制EHEC O157的生长，破坏细胞膜结构,增加细胞膜的通透性,导致细菌死亡。肉桂精油存在情况下，能有效干扰EHEC O157蛋白质的合成能力，影响细胞膜与细胞壁之间的结构的稳定性，破坏菌体正常的TCA循环，中断部分呼吸链的电子传递。研究为植物精油应用于生物抑菌剂提供了依据,对保障食品安全具有重要意义。
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