副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为革兰氏阴性细菌，是常见的食源性致病菌之一。该菌主要存在于海洋环境中，常见于贝类、虾、鱼类等海产和盐渍食品如咸菜、腌肉中[1]。研究表明副溶血弧菌毒力因子主要是耐热直接溶血素(thermotolerant direct hemolysin, TDH)、相对耐热溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)和不耐热溶血素(thermolabile hemolysin, TLH)，能引起急性肠胃炎，伴随有呕吐、腹痛、腹泻、低烧和头痛等症状[2]。在我国，副溶血弧菌引起的食物中毒事件高发于广东、上海、浙江等沿海城市，并高居微生物性食物中毒的第二位[3]。在国外，副溶血弧菌引起中毒事件在日本、韩国、美国、西班牙、法国等地都有报道，严重危害着公众健康。
副溶血弧菌能够直接附着在食品加工设备或非食品加工部件的表面，如墙壁和排水管上形成生物被膜，造成食品污染或设备腐蚀[4]。生物被膜具有严重的致病性，能够分泌不同表面因子和毒力因子。另外，生物被膜也能促进细菌之间的基因转移，这可能导致毒力株的数量增加[5]。与浮游形式相比，细菌以生物被膜形式存在时，耐药性可增加10～1 000倍[6]。主要原因是生物被膜包裹的胞外多聚物基质(多糖、蛋白质、脂质、DNA)可以形成一道天然的屏障，阻止抗生素在生物被膜内部扩散[7]。此外，营养物质缺乏、代谢废物积累、致密的空间结构等恶劣的微环境导致生物被膜内部活的非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态细胞的形成[8]。因此，生物被膜利用其对环境的适应性以及对酸、碱、氧化剂甚至抗生素等多种药物的耐受性，保护其内部细菌在外界环境发生不利变化的情况下依然能够生长和繁殖，这使得致病菌和腐败菌的防控变得极其困难。
目前，在食品工业中，大多使用次氯酸钠、乳酸、过氧化氢等消毒剂进行灭菌处理，但这些消毒剂并不能完全清除致病菌生物被膜，而且其安全性也越来越受到消费者的关注[9]。此外，长期使用抗生素已导致大量致病菌形成耐药性，这对未来致病菌感染的防控与治疗极其不利[10]。因此，作为消毒剂和抗生素替代品之一的植物精油是当前研究的热点。薰衣草精油(lavender essential oil,LEO)因其生物特性和独特的香气在食品工业中有很大的开发潜能。薰衣草精油最重要的特性是抗菌活性，如抗细菌、抗真菌、抗病毒、杀线虫等[11]。此外，薰衣草精油还具有多种药理特性，如抗氧化、抗炎、镇静、催眠、镇痛和抗癌等[12]。因此本研究首先考察副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下生物被膜的形成情况，在此基础上进一步分析不同浓度的薰衣草精油和4种常用抗菌剂对两种温度下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜的清除效果，并探究低温环境对副溶血弧菌成熟生物被膜抗性的影响，这对消除副溶血弧菌污染、控制食品腐败变质和保障食品安全具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
副溶血弧菌ATCC17802，广东微生物菌种保藏中心；薰衣草精油，青岛优索化学科技有限公司；乳酸、柠檬酸、次氯酸钠、过氧化氢，广州牌化学试剂厂；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×SGExcel Fast SYBR mixture、四唑鎓盐(XTT)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)，上海生工(生物工程)股份有限公司；甲萘醌，美国Sigma公司；FITC Con-A染料、叠氮溴化丙锭(propidium monoazade, PMA)，美国Biotium公司。
含3%(质量分数) NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic soy broth, TSB)：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 30 g、去离子水1 L，pH值为7.0～7.4，121 ℃灭菌20 min。含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基(tryptic soy agar, TSA)：在上述TSB配方的基础上加入1.8%(质量分数)的琼脂，用于平板计数法测定可培养细菌数。水解酪蛋白胨肉汤(mueller hinton broth, MHB)：称取MHB培养基21 g，加入去离子水1 L，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
Forma ClassⅡ A2生物安全柜、Multiskan FC酶标仪，Thermo公司；台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；650 W卤钨灯，德国Osram公司；CFX96TM荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；LSM 780激光共聚焦扫描显微镜，德国Zeiss公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株和培养条件
副溶血弧菌接种于含3% NaCl的TSB培养基中，37 ℃、150 r/min培养12 h后，4 ℃条件下，6 000 r/min离心10 min收集菌体，以无菌生理盐水调整菌液浓度为107 CFU/mL备用。
1.3.2 生物被膜的形成及定量
采用结晶紫染色法(crystal violet staining, CV)测定生物被膜的生物量。在12孔板中垂直放置无菌玻璃片(20 mm×20 mm)，将副溶血弧菌菌液与TSB培养液按体积比1∶4混匀后(菌液终浓度为107 CFU/mL)，以每孔5 mL加入到孔板中，在32 ℃及10 ℃分别培养1 d及30 d。培养完成后，将附着生物被膜的玻璃片用无菌PBS清洗3次后，65 ℃干燥固定30 min，再在孔中加入0.1%结晶紫染色30 min，用无菌PBS清洗3次，干燥后，加入33%冰乙酸脱色10 min，用酶标仪测定595 nm下的吸光度。
1.3.3 代谢活性的测定
采用XTT法测定成熟生物被膜的代谢活性。XTT用PBS配制成1 g/mL的溶液，-80 ℃保存备用，甲萘醌在使用前溶解在丙酮中，使其终浓度为1 mmol/L。将附有生物被膜的玻璃片转移至含有PBS和玻璃珠的无菌离心管中，涡旋振荡2 min后，收集生物被膜悬液。在96孔板中每孔中加入100 μL悬液，然后将XTT溶液和甲萘醌溶液按体积比12.5∶1混合后，每孔加入50 μL，黑暗中37 ℃温育4 h，用酶标仪测定450 nm下的吸光度。
1.3.4 生物被膜中活菌、可培养菌和VBNC菌数量的测定
采用PMA-qPCR法定量生物被膜中活菌数。取0.5 mL副溶血弧菌菌液于1.5 mL离心管中，加入PMA(终浓度为40 μmol/L)充分混匀，避光处理5 min 后开盖置于冰上，距离650 W卤钨灯20 cm曝光5 min。处理后的样品8 000 r/min离心2 min收集菌体，加入40 g/L溶菌酶37 ℃处理1 h。按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取副溶血弧菌的DNA，-20 ℃保存备用。
根据GenBank中的副溶血弧菌ATCC17802 tlh基因，在保守区域用Primer 5.0设计PCR引物，并用Primer-BLAST验证。上游引物序列(5’→3’)TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATG，下游引物序列(5’→3’)CGGTGAGTTGCTGTTGTTGGAT，由上海生工(生物工程)股份有限公司合成。
PMA-qPCR反应体系为25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(终浓度为20 μmol/L)，副溶血弧菌模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共39个循环。循环结束后72 ℃保持5 min。溶解曲线：65 ℃升至95 ℃，0.5 ℃/s。
采用稀释平板法测定生物被膜中可培养菌数。吸取100 μL 10倍梯度稀释的菌液，均匀涂布于含3% NaCl的TSA平板上，37 ℃培养24～48 h后计数。
活菌数与可培养菌数的差值即为VBNC菌的数量。
1.3.5 最低抑菌浓度的测定
采用96孔板微量稀释法测定不同抗菌剂的最低抑菌浓度(minimum inbibitory concentration, MIC)。将抗菌剂以MHB培养基2倍稀释成8个梯度。每个孔中加入100 μL MHB培养基，然后，再在每个孔中加入100 μL菌液，使菌液终浓度为107 CFU/mL，同时设置不含抗菌剂的对照组。孔板在32 ℃下恒温培养24 h后，用酶标仪在595 nm处测定OD值。MIC被定义为抑制副溶血弧菌生长的抗菌剂的最低浓度。
1.3.6 不同抗菌剂对副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用
根据1.3.2中的方法，制备副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下形成的成熟生物被膜。将附有成熟生物被膜的玻璃片取出用PBS清洗3次，去除浮游菌，然后向各孔中分别加入5 mL不同浓度(1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC)的抗菌剂，在32 ℃和10 ℃处理3 h后，按照上述方法测定生物被膜生物量和代谢活性的变化，按公式(1)计算清除率，同时测定活菌数和可培养菌数。
清除率
(1)
1.3.7 激光共聚焦显微镜观察生物被膜
将生物被膜用PBS缓冲液洗涤3次，用滤纸轻轻擦去多余的水分，黑暗环境下在载玻片上加入5 μL的绿色荧光素标记刀豆球蛋白A(fluorescein isothiocyanate-concanavalin A, FITC Con-A)混合溶液，于4 ℃下放置30 min，再加入5 μL的PI于4 ℃下放置15 min，盖上盖玻片。在激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)下观察生物被膜，激发波长为488 nm，发射波长为500～550 nm，用Image J软件分析生物被膜多糖厚度及死菌数量的变化。
1.3.8 数据处理
实验重复3次及以上，取平均值，利用GraphPad Prism 8.0作图，以SPSS 20进行数据分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同温度下副溶血弧菌生物被膜的形成
由图1-a所示，副溶血弧菌在32 ℃下培养48 h后，生物被膜总量达到最多，代谢活性最强，随着培养时间延长至72 h，生物被膜总量及代谢活性也随之减少，结果表明副溶血弧菌生物被膜在32 ℃下48 h后达到成熟。图1-b表明，副溶血弧菌在10 ℃下第6天时生物量以及代谢活性最大。取副溶血弧菌在32 ℃、16 h 和10 ℃、6 d下的生物被膜计算活菌数，结果分别为(5.56±0.62) lgCFU/cm2、(5.48±0.1)lgCFU/cm2，通过t检验没有显著差异。
a-32 ℃；b-10 ℃
图1 副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下形成的生物被膜的
生物量和代谢活性
Fig.1 The biomass and metabolic activity of V.parahaemolyticus
biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃
2.2 薰衣草精油对不同温度下形成的副溶血弧菌生物被膜的清除作用
薰衣草精油、柠檬酸、乳酸、次氯酸钠、过氧化氢对副溶血弧菌MIC值分别为0.4%(体积分数)、0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25%(体积分数)、0.004 7%(体积分数)。对于32 ℃下形成的副溶血弧菌常温生物被膜，薰衣草精油的清除率随着处理浓度的增加而增大，在1/2 MIC～4 MIC清除率为36.39%～72.38%，值得注意的是，1/2 MIC和MIC的薰衣草精油对生物被膜的清除效果与其他4种抗菌剂差别不明显，而2 MIC浓度的薰衣草精油对生物被膜清除率显著高于其他4种抗菌剂(图2-a)。对于10 ℃ 下形成的副溶血弧菌低温生物被膜，1/2 MIC和MIC的薰衣草精油的清除率为58.20%和60.18%，明显高于其他4种抗菌剂；2 MIC和4 MIC 的薰衣草精油表现出更加显著的清除效果，清除率分别为65.40%和67.62%(图2-b)。总的来说，薰衣草精油对副溶血弧菌成熟生物被膜清除效果优于其他4种抗菌剂，而且对低温生物被膜也展示出较强的清除能力。
a-32 ℃；b-10 ℃
图2 不同浓度的抗菌剂对32 ℃和10 ℃下形成的副溶血
弧菌生物被膜的清除效果
Fig.2 The removal effects of antimicrobial agents on mature
biofilms of V.parahaemolyticus formed at 32 ℃ and 10 ℃
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.3 薰衣草精油对不同温度下形成的副溶血弧菌生物被膜代谢活性的影响
对于32 ℃下形成的副溶血弧菌常温生物被膜，薰衣草精油可显著降低其代谢活性，强于其他4种抗菌剂，在1/2 MIC～4 MIC，代谢活性下降35.72%～71.38%(图3-a)。对于10 ℃下形成的副溶血弧菌低温生物被膜，1/2 MIC～4 MIC的薰衣草精油可使其代谢活性降低42.06%～50.48%(图3-b)。薰衣草精油能够通过破坏副溶血弧菌成熟生物被膜作用于内部菌体，从而影响生物被膜细胞的代谢活性。此外，结果亦表明低温生物被膜对抗菌剂的抗性明显强于常温生物被膜。
2.4 薰衣草精油处理对副溶血弧菌生物被膜活菌数的影响
采用4种浓度的薰衣草精油处理2种温度下形成的副溶血弧菌生物被膜3 h，活菌数和可培养菌数如图4-a所示，经过薰衣草精油处理后，32 ℃生物被膜较10 ℃生物被膜菌数下降明显，4 MIC处理下，32 ℃生物被膜活菌数减少3.96 lgCFU/cm2，可培养菌数减少5.94 lgCFU/cm2。图4-b显示10 ℃低温生物被膜活菌数减少2.88 lgCFU/cm2，可培养菌数减少3.93 lgCFU/cm2。上述结果表明，薰衣草精油对副溶血弧菌成熟生物被膜具有良好的清除效果。此外，生物被膜内活菌数与可培养菌数的差值即为VBNC菌的数量，表明薰衣草精油处理后可诱导副溶血弧菌生物被膜中VBNC菌的形成。
a-32 ℃；b-10 ℃
图3 不同浓度的抗菌剂对32 ℃和10 ℃下形成的副溶血
弧菌生物被膜代谢活性的影响
Fig.3 The effects of antimicrobial agents on the metabolic activity
of V.parahaemolyticus mature biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃
a-32 ℃；b-10 ℃
图4 薰衣草精油对32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧
菌生物被膜细胞的影响
Fig.4 The effects of LEO on the cells in V.parahaemolyticus
biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃
2.5 激光共聚焦显微镜观察薰衣草精油处理下的生物被膜结构
使用CLSM观察4 MIC的薰衣草精油对副溶血弧菌生物被膜的清除效果，图5-a和图6-a分别为未处理的32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜，呈现出密集分布的三维结构，而且多糖和活/死细胞在生物被膜中分布密集，活细胞数量显著高于死细胞。图5-c是4 MIC薰衣草精油处理后的常温生物被膜，多糖大部分被清除，绿色荧光面积下降54%；且含有大量死细菌，红色荧光面积增加80%。图6-c为4 MIC薰衣草精油处理后的低温生物被膜，多糖含量比对照组显著减少，死菌增多。上述结果表明薰衣草精油能够破坏生物被膜的结构，有效清除生物被膜胞外多糖，杀灭部分生物被膜细胞。此外，薰衣草精油对低温生物被膜的清除能力弱于常温生物被膜，表明低温生物被膜的抗性较强。
a、c-处理前后的32 ℃生物被膜胞外多糖和死菌分布；
b、d-处理前后的32 ℃生物被膜胞外多糖和死菌的荧光强度
图5 CLSM观察4 MIC薰衣草精油处理32 ℃下形成的
副溶血弧菌生物被膜结构
Fig.5 The structure of the biofilm formed at 32 ℃
treated with 4 MIC of LEO observed by CLSM
注：绿光标记多糖，红光标记死菌(下同)
a、c-处理前后的10 ℃生物被膜胞外多糖和死菌分布；
b、d-处理前后的10 ℃生物被膜胞外多糖和死菌的荧光强度
图6 CLSM观察4 MIC薰衣草精油处理10 ℃下形成的
副溶血弧菌生物被膜结构
Fig.6 The structure of the biofilm formed at 10 ℃
treated with 4 MIC of LEO observed by CLSM
3 结论
本研究考察了32、10 ℃下副溶血弧菌生物被膜的形成情况，分析了薰衣草精油对其成熟生物被膜的清除作用，并选择食品工业中常用的几种抗菌剂作为对照处理。32 ℃是副溶血弧菌适宜的生长温度，而且为中国南方夏季常见的温度。此外，冷藏食品在整个贮藏、运输和销售过程中的温度为2～5 ℃，通常会升高至10 ℃左右[13]。CHUNG等[14]测定不同贮藏温度下韩国传统酱腌蟹中副溶血弧菌的生长曲线发现，副溶血弧菌在10 ℃下能长时间存活。WONG等[15]研究也发现副溶血弧菌能在4～30 ℃下存活。BURNHAM等[16]将6 lgCFU/mL的副溶血弧菌在10 ℃ 下培养10 d，其数目可达8.31 lgCFU/mL。因此，本研究亦考察10 ℃低温对副溶血弧菌生物被膜形成及抗性的影响。我们使用激光共聚焦显微镜并结合Z-TACK层切技术和IMAGE J软件分析副溶血弧菌生物被膜结构发现，低温生物被膜厚度较常温生物被膜略薄，但底部细胞分布较密集，而常温生物被膜细胞分布较均匀。
与常用的4种抗菌剂相比，薰衣草精油对副溶血弧菌成熟生物被膜展现出最强的清除作用，次氯酸钠次之，柠檬酸、乳酸和过氧化氢作用效果依次降低。CLSM结果表明，对照组副溶血弧菌菌体之间相互黏附形成致密生物被膜，而薰衣草处理组生物被膜结构被破坏，菌体分散。
等[17]研究发现薰衣草精油通过破坏金黄色葡萄球菌生物被膜结构，渗透到生物被膜内部，使得膜内细胞因代谢活性降低而死亡。
等[18]报道薰衣草精油能显著抑制空肠弯曲菌的黏附和运动能力，从而抑制生物被膜的形成。薰衣草精油主要成分为芳樟醇和乙酸芳樟酯，DE RAPPER等[19]发现，这些成分能够破坏细胞膜的脂质层，导致蛋白质、ATP和DNA等膜内关键大分子泄露。CHERRAT等[20]也报道，薰衣草精油可以穿过细胞膜脂质层，然后与膜内蛋白质相互作用，干扰其功能，而且其能够使细胞膜表面硬化，降低膜的通透性。
此外，研究也发现副溶血弧菌低温生物被膜对抗菌剂的抗性明显强于常温生物被膜，可能的原因是低温环境能够诱导副溶血弧菌成熟生物被膜中VBNC状态细胞的形成。VBNC状态是指细菌不能在传统培养基上生长繁殖，但仍具有活性，并可在适宜条件下复苏的特殊状态[21]。与正常细胞相比，VBNC细胞表现出比可培养的细胞更低的代谢活性，但能继续保持膜完整性并产生蛋白质[22]。NOWAKOWSKA等[23]发现低温诱导的创伤弧菌进入VBNC状态，从而对氧化应激、热、pH、渗透压、抗生素、乙醇和重金属具有更强的耐受性。我们研究发现，副溶血弧菌在低温条件下形成的成熟生物被膜中约有1/3的细胞进入了VBNC状态。黄韵等[24]研究也表明，单增李斯特菌在2 ℃的低温条件下培养比在25 ℃更早的进入VBNC状态。本文研究表明，薰衣草精油对成熟生物被膜细胞的杀灭作用随着浓度的增加而增大，生物被膜中活细胞和可培养细胞数量逐渐降低，而且其对常温生物被膜细胞杀灭作用显著强于低温生物被膜细胞，这一结论也证实常温生物被膜对抗菌剂具有更高的敏感性。
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