蓝莓富含花青素、多酚类等多种活性成分，具有高效清除氧自由基的作用，是一种营养价值丰富的浆果[1]。近年来，我国的蓝莓产业发展迅速，蓝莓栽培面积和产量均显著增加，开发前景巨大，经济效益可观。目前，应季鲜果是蓝莓的主要消费途径，然而，蓝莓鲜果采摘后感染腐败微生物的几率大，不易长久保存，这对于拓展蓝莓消费市场极为不利。鲜果精深加工是有效延长蓝莓产品保藏期的重要手段，可延伸蓝莓的产业链，赋予蓝莓更高的经济价值。
微生物发酵技术在鲜果加工产业中应用广泛，该技术的蓬勃发展使其迅速成为蓝莓精深加工的研究热点[2]。在市场上常见的微生物发酵加工制成的蓝莓产品有果醋、果酒、酵素、果汁等，这些产品能在蕴含蓝莓自然芳香的基础上，通过微生物发酵保留大部分营养成分或转化形成新的活性物质[3]。益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成，对宿主有益的一类活性微生物，应用最广泛的益生菌有乳酸菌和酵母菌等[4]。目前，益生菌在市场上主要以发酵乳制品的形式出售，如酸奶等[5]。然而，乳制品中存在致敏原，导致部分消费者无法放心食用，因此，近年来越来越多的研究者开展了益生菌发酵非乳制品的相关研究[6-7]。果蔬汁具有蛋白质、矿物质、糖、脂肪、维生素等多种营养成分，是开发非乳制品益生菌饮料的理想基质[7-8]。目前，利用益生菌加工蓝莓多见于乳酸菌与酵母菌的发酵[9]，或者是蓝莓的自然发酵[10]，而乳酸菌与酵母菌复合发酵可进一步提高发酵产品的抗氧化等性能[11-12]。以蓝莓鲜果为原料，经益生菌发酵加工而成的发酵饮品，是拓展蓝莓产业的新方向。
因此，本文利用实验室优质益生菌(植物乳杆菌Picp-2和单胞酿酒酵母菌ZLG-6)对蓝莓鲜果进行单一和复合菌种发酵，以蓝莓鲜果发酵液的抗氧化活性、酚类物质含量和产品感官评分为标准对不同发酵方式进行评估。旨在开发高抗氧化活性的蓝莓发酵饮品，提高蓝莓鲜果的附加值，丰富蓝莓饮品的种类。
1 材料与方法
1.1 实验材料
新鲜蓝莓果榨汁(品种为“兔眼”)；乳酸菌：植物乳杆菌Picp-2(菌种保藏号：M20191045，保藏于中国典型培养物保藏中心)；酵母菌：单胞酿酒酵母菌ZLG-6(菌种保藏号：M20191046，保藏于中国典型培养物保藏中心)；MRS培养基，杭州百思生物技术有限公司；YPD培养基：酵母提取物1%、葡萄糖2%和大豆蛋白胨2%。
1.2 实验方法
将乳酸菌与酵母菌分别在MRS和YPD培养基中活化，当OD600值达到(0.5±0.05)时，可用于发酵蓝莓鲜果。
取蓝莓鲜果榨汁，按照200 mL每瓶分装于250 mL的蓝盖瓶中，75 ℃条件下处理30 min。按相应接种量加入已活化的乳酸菌或酵母菌，混匀，置于培养箱中发酵。
1.2.1 自然发酵
在30 ℃下进行发酵。
1.2.2 单一菌种发酵
植物乳杆菌Picp-2接种量10%，在37 ℃下发酵；单胞酿酒酵母菌ZLG-6的接种量1%，在30 ℃下发酵。
1.2.3 复合菌种发酵
先接入植物乳杆菌Picp-2发酵3 d(接种量10%，培养温度37 ℃)，再接入单胞酿酒酵母菌ZLG-6继续发酵10 d(接种量1%，培养温度30 ℃)。
1.2.4 评价与分析
发酵周期13 d，发酵结束得蓝莓发酵饮品。将蓝莓发酵饮品离心，测定抗氧化活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和酚类物质含量。
1.3 实验方法
1.3.1 体外抗氧化能力的检测
1.3.1.1 DPPH自由基清除率的测定[13]
在1 mL待测样品中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀静置30 min，517 nm波长处测吸光值。每个样品设置3个平行。用蒸馏水将待测样品稀释成不同的浓度，测定不同浓度样品的DPPH自由基清除能力，通过Origin软件拟合，计算IC50值。IC50值定义为当清除率为50%时，1 mL待测样品中所含蓝莓发酵饮品原液的体积(mL/mL)，所需浓度越低，表明该物质抗氧化性越强。DPPH自由基清除率A1计算如公式(1)所示：
(1)
式中：As，1 mL待测样品加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Ax，1 mL样品加1 mL溶剂的吸光值；A0，1 mL DPPH乙醇溶液加1 mL溶剂的吸光值。
1.3.1.2 ·OH清除率的测定[14]
采用Fenton反应法，反应体系中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液、待测样品或蒸馏水(对照)各2 mL，静置10 min后加入2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，静置30 min，测定510 nm波长下的吸光值。参考1.3.1.1的方法计算IC50值。·OH清除率A2计算如公式(2)所示：
(2)
式中：A0，待测样品的吸光值；Ax，蒸馏水(对照)的吸光值。
1.3.1.3 ABTS阳离子自由基清除率的测定[15]
各取0.2 mL 7.4 mmoL/L ABTS与2.6 mmoL/L K2S2O8溶液，混匀后暗处反应12 h，再用95%乙醇稀释40～50倍，使该混合液(工作液)在734 nm波长下的吸光值处于0.68～0.72。将0.8 mL工作液与0.2 mL待测样品或95%乙醇(对照)混匀，静置6～8 min，测定734 nm波长下的吸光值。参考1.3.1.1的方法计算IC50值。ABTS阳离子自由基清除率A3计算如公式(3)所示：
(3)
式中：A0,待测样品的吸光值；Ax，95%乙醇(对照)的吸光值。
1.3.2 总多酚含量测定[16]
以没食子酸作为标准品，采用福林-西奥卡特法测定总多酚含量。将0.1 mL待测样品与0.05 mL Folin-Ciocalteu试剂混合，反应3～8 min后加入0.15 mL质量浓度200 g/L的Na2CO3溶液，反应60 min后，在765 nm波长处测量吸光值，以没食子酸为标准品制作总多酚含量的标准曲线，根据标准曲线计算总多酚含量，总多酚的含量以没食子酸(g/L)表示。
1.3.3 SOD活力检测
SOD活力用WST-1法检测，参考试剂盒说明书进行操作。
1.3.4 感官评分评价方法
征求25名志愿者品尝蓝莓鲜果发酵饮品，从色泽、口味、气味与体验感4个方面进行独立打分，总分10分，评分细则参照表1。
表1 蓝莓鲜果发酵饮品评分细则
Table 1 Detailed grading rule for probiotics fermented blueberry drinks
类型分数(分)评价标准[17]色泽2.5深紫红色、清明透亮、不浑浊、颜色与鲜蓝莓果汁是否相符、少悬浊物最好气味2.5蓝莓特有果蔬香味、蓝莓发酵后的酵素醇香、不难闻、浓度合适、无异味口味2.5有无饮品酸甜味道、不辣口、不酸涩、有蓝莓风味、清爽不单调体验感2.5适合做发酵饮品、符合大众口味、与市场相关产品比较如何
2 结果与分析
2.1 不同发酵方式对体外抗氧化活性的影响
氧化损伤是人体衰老的主要原因，还可引起高血脂、糖尿病及心脑血管疾病等。果蔬经益生菌发酵后，其制品的抗氧化能力显著增强，因为益生菌在发酵过程中可水解一些结合酚，释放游离酚，提高生物利用率，从而提高抗氧化能力[18]。蓝莓中富含的花青素、多酚类物质，具有很强的抗氧化性。图1为不同发酵方式发酵饮品的抗氧化能力，图2为相应IC50。
图1 发酵方式对蓝莓鲜果发酵饮品抗氧化能力的影响
Fig.1 Effects of fermentation methods on antioxidant capacity of fermented blueberry drinks
如图1所示，蓝莓鲜果发酵饮品的DPPH自由基清除率在自然发酵、乳酸菌、酵母菌与复合发酵的条件下，分别为96.65%、98.4%、97.67%和96.76%，其DPPH自由基清除率的IC50值分别为(0.78±0.05)、(0.52±0.06)、(0.56±0.06)和(0.42±0.04)mL/mL(图2)，说明经由复合发酵所获得的蓝莓发酵饮品，其DPPH自由基的清除能力最强。蓝莓鲜果发酵饮品的·OH清除率在自然发酵、乳酸菌、酵母菌与复合发酵的条件下，分别为80.97%、85.69%、86.36%和85.3%(图1)，经计算，·OH清除率的IC50值分别为(0.62±0.06)、(0.53±0.04)、(0.52±0.03)和(0.54±0.02)mL/mL(图2)，说明经益生菌发酵后，其·OH清除率相较于自然发酵状态更高，但·OH的清除率在单一菌株发酵和复合发酵的条件下，未见明显差异。蓝莓鲜果发酵饮品的ABTS阳离子自由基清除率在自然发酵、乳酸菌、酵母菌与复合发酵的条件下，分别为80.64%、86.64%、90.32%和91.76%，其ABTS阳离子自由基清除率的IC50值分别为(0.69±0.02)、(0.58±0.03)、(0.46±0.02)和(0.41±0.03)mL/mL，说明相较于自然发酵，添加益生菌有助于提高蓝莓鲜果发酵饮品的ABTS阳离子自由基清除率，且复合菌种发酵的效果优于单一菌种发酵。
发酵体系的稳定性是考量蓝莓鲜果发酵饮品品质是否稳定的重要因素[19]。从图1可知，乳酸菌或酵母菌这类经由单一菌种发酵的体系，其稳定性显著优于自然发酵或复合发酵的体系。说明在发酵体系中添加益生菌使其成为优势菌种，更有利于发酵系统的稳定性；复合发酵体系的稳定性低于单一菌种发酵，推测发酵体系中菌种的种类越复杂，其稳定性控制的难度越高。
图2 不同发酵方式下蓝莓鲜果发酵饮品清除 自由基的IC50值
Fig.2 IC50 values of free radical scavenging rates of fermented blueberry drinks using different fermentation methods
2.2 不同发酵方式对SOD活力的影响
SOD是机体内能够清除超氧阴离子自由基的预防型抗氧化剂，可用于衡量机体抗氧化能力强弱[20]。蓝莓鲜果发酵饮品在自然发酵、乳酸菌、酵母菌与复合发酵的条件下，其SOD活力分别为255.23、296.31、261.04、300.93 U/mL(图3)。结果表明，益生菌的发酵过程可促进蓝莓鲜果发酵饮品SOD活力的增加，尤其是乳酸菌的添加可显著提高发酵体系中SOD活力水平[21]。
图3 发酵方式对蓝莓鲜果发酵饮品SOD活力的影响
Fig.3 Effects of fermentation methods on SOD activity of fermented blueberry drinks
2.3 不同发酵方式对总多酚含量的影响
植物多酚具有抗癌、抗衰老、预防心脑血管疾病、抗氧化等多种生物活性，在延缓衰老、增强免疫力、保护视力、改善弱视、抗氧化、保护人体免受自由基的损伤等方面效果显著[22]。从图4可知，蓝莓鲜果发酵饮品在自然发酵、乳酸菌、酵母菌与复合发酵的条件下，其总多酚含量分别为6.82、6.16、6.84、7.07 g/L，与自然发酵相比，乳酸菌发酵的体系中其总多酚含量显著降低，酵母菌发酵的体系未见明显差异，但复合发酵体系中的总多酚含量高于自然发酵，推测蓝莓鲜果在乳酸菌与酵母菌的协同作用下，可提高该发酵饮品中的总多酚含量。
图4 发酵方式对蓝莓鲜果发酵饮品总多酚含量的影响
Fig.4 Effects of fermentation methods on the content of total polyphenols in fermented blueberry drinks
2.4 不同发酵方式对感官评价的影响
由图5可知，蓝莓鲜果发酵饮品在自然发酵、乳酸菌、酵母菌与复合发酵的条件下，其感官评分分别为4.68、8.66、8.35和8.98，说明在蓝莓鲜果发酵过程中添加益生菌，可有效地提高发酵饮品的感官评价，尤其是乳酸菌发酵过程中可产生大量的风味物质，可赋予发酵饮品更怡人的感官享受。
图5 发酵方式对蓝莓鲜果发酵饮品感官评价的影响
Fig.5 Effects of fermentation methods on sensory evaluation of fermented blueberry drinks
3 结论
以榨汁的蓝莓鲜果为原料，利用本研究室筛选的植物乳杆菌Picp-2和单胞酿酒酵母菌ZLG-6制备蓝莓鲜果发酵饮品，通过比较饮品的抗氧化性能、SOD活力、总多酚含量和感官评价，发现复合发酵的方式优于自然发酵和单一菌种发酵，是最适于加工蓝莓鲜果发酵饮品的工艺。该工艺条件下，蓝莓鲜果发酵饮品的DPPH自由基清除率为96.76%(IC50值为0.42 mL/mL)、·OH清除率为85.30%(IC50值为0.54 mL/mL)、ABTS阳离子自由基清除率为91.76%(IC50值为0.41 mL/mL)、SOD活力为300.93 U/mL、总多酚含量为7.07 g/L、感官评分为8.98。本研究确定了蓝莓鲜果发酵饮品的最佳发酵方式，获得了一款具有高抗氧化性能的富营养蓝莓饮品，为深入研究蓝莓鲜果发酵饮品的制备工艺奠定了理论和数据基础。
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