大豆蛋白食品具有保健、预防相关疾病的功效，诸如调节人体血脂，降低胆固醇、脂肪肝，减少患心血管病的危险，预防胆结石的形成；调节人体钙质的代谢，从而降低患骨质疏松症的危险，预防肾结石的形成；调节性激素效应，从而减轻妇女更年期综合征症状等[1-2]。但大豆分离蛋白分子质量较大，分子结构也较为复杂，食用后消化吸收慢，且含有多种抗营养因子[3]、致敏成分[4]等，影响其营养价值及应用。作为一种先进的蛋白质加工技术，“酶膜耦合”定向酶解，联合复合菌种发酵技术可解决上述问题。该技术，可破坏原料蛋白过敏原的构象表位和线性表位，降低过敏性风险，去除抗营养因子，改善消化吸收特性。但针对此技术生产的发酵大豆蛋白肽粉营养价值及功效性未见报告，故本研究开展发酵大豆蛋白肽粉的营养价值及功效性研究，以期为以后的应用提供支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
大豆分离蛋白，禹王；乳清蛋白(蛋白质含量≥80%)，丹麦Arla；发酵大豆蛋白肽粉：以大豆分离蛋白为原料，先通过蛋白酶进行部分酶解，然后使用类干酪乳杆菌、戊糖片球菌复合菌种发酵制得；野生型AB品系斑马鱼：实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2012—0171，饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
1.1.2 试剂
胃蛋白酶和胰酶，Sigma；4%组织细胞固定液，Solarbio；二甲苯，上海麦克林生化科技有限公司；PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；Mayer苏木素染色液、伊红染色液、中性树脂封片剂，上海依赫生物科技有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
CX31生物显微镜、SZX7解剖显微镜，日本OLYMPUS；VertAl CCD相机，上海土森视觉科技有限公司；CP214精密电子天平，美国OHAUS；6孔板、12孔板、96孔板，中国Nest Biotech；SPARK多功能酶标仪，瑞士TECAN。
1.3 实验方法
1.3.1 体外消化模拟试验
胃消化、肠道消化模拟实验方法参考文献[5]。
1.3.2 致敏性评价试验
检测方法及原理参考文献[6-7]，详细操作如下：随机选取300尾4 dpf野生型AB品系斑马鱼于12孔板中，每孔(实验组)均处理10尾斑马鱼。根据前期浓度摸索结果，发酵大豆蛋白肽粉对正常斑马鱼的无可见有害作用水平(no observed adverse effect level,NOAEL)为500 μg/mL，以NOAEL剂量1/9、1/3和1设定低剂量组、中剂量组和高剂量组，即发酵大豆蛋白肽粉质量浓度为55.6、167、500 μg/mL，同时设置正常对照组。每孔容量为1 mL，每个实验组设置6个平行。各实验组与N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline HCl, BAPNA)共同处理24 h后，将液体转移至96孔板中，250 μL/孔，利用酶标仪检测各实验组类胰蛋白酶的相对吸光度值，以吸光度值(平均值±标准差)评价发酵大豆蛋白肽粉诱发类过敏的情况。
1.3.3 肌肉保护试验
检测方法参考COFFEY等[8]研究,详细操作如下：随机选取120尾2 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。除正常对照组外，其余各实验组均给予1.5%无水乙醇、24 h，建立斑马鱼酒精性肌损伤模型。分别给予以下样品：发酵大豆蛋白肽粉和乳清蛋白质量浓度均为102.30 μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。28 ℃处理24 h后，用4%组织细胞固定液固定，对斑马鱼进行苏木精-伊红染色(固定-脱水-包埋-切片-染色)，并进行病理学分析评价样品肌肉保护功效。评分标准见表1。
表1 斑马鱼肌肉保护功效评价标准
Table 1 Evaluation criteria for muscle protection of zebrafish
组别/分值0分1分2分3分4分长度 均一长条状少量缩短部分缩短大量缩短整体缩短或缺失清晰度清晰无不规则少量不规则部分不规则大量不规则横纹混乱或缺失松弛度肌纤维未见松弛少量松弛部分松弛大量松弛整体松弛或缺失浸润度肌纤维未见浸润少量浸润部分浸润大量浸润整体浸润或坏死坏死度肌纤维未见坏死少量坏死部分坏死大量坏死完全坏死或缺失
2 结果与分析
2.1 营养成分分析
由表2、表3可以看出，大豆分离蛋白粉通过部分酶解，蛋白质的含量略有降低，但氨基酸构成比例几乎没有变化，但发酵大豆蛋白肽粉形成整蛋白、多肽、低聚肽、氨基酸等多重氮源，可以实现梯度吸收，降低代谢负担。通过发酵，碳水化合物含量略有增加，主要是因为通过发酵产生一定量有机酸等后生元成分。有机酸能够提高胃酸分泌量，促进营养物质的消化吸收。同时有机酸可以降低肠道内pH值，具有重要的肠道调节功能。
表2 发酵大豆蛋白肽粉与大豆分离蛋白粉营养成分对比分析
Table 2 Nutritional components of fermented soybean protein peptide powder and soybean protein isolate powder
检测指标检测方法大豆分离蛋白粉发酵大豆蛋白肽粉蛋白质/[g·(100 g)-1]GB 5009.5—2016第一法90.787.2水解氨基酸/[g·(100 g)-1]GB 5009.124—201688.1785.80游离氨基酸/[g·(100 g)-1]GB/T 22492—2008 附录B未检出0.6肽含量/[g·(100 g)-1]GB 5009.124—2016/21.5肽分子量≥5 0005 000<肽分子量>1 000肽分子量≤1 000GB/T 22492—2008 附录A///37%22.7%40.3%碳水化合物/[g·(100 g)-1]GB 28050—20110.653.99脂肪含量/[g·(100 g)-1]GB 5009.6—2016 第二法3.83.3总酸/[g·(100 g)-1]GB 12456—20210.923.12脲酶(尿素酶)活性GB 5413.31—2013阴性阴性
注：/，未检测
2.2 体外消化模拟试验
大豆分离蛋白粉通过部分酶解及复合菌种发酵之后胃消化率由原来的68.57%提高到81.61%，肠消化率由原来的76.35%提高到87.49%。发酵大豆蛋白肽粉可能是通过部分酶解形成蛋白质和肽混合，通过发酵产生一些有机酸等代谢产物，这些成分在水溶液中会通过分子间相互作用力，比如氢键、范德华力等相互结合，使得蛋白酶与蛋白质的结合位点被暴露，从而促进蛋白的消化。
表3 发酵大豆蛋白肽粉与大豆分离蛋白粉氨基酸组成对比分析 单位：%
Table 3 Amino acids composition of fermented soybean protein peptide powder and soybean protein isolate powder
氨基酸大豆分离蛋白粉发酵大豆蛋白肽粉氨基酸大豆分离蛋白粉发酵大豆蛋白肽粉天冬氨酸10.139.63亮氨酸7.096.42苏氨酸2.742.75酪氨酸3.063.17丝氨酸3.573.54苯丙氨酸4.824.53谷氨酸17.717.1组氨酸2.213.01甘氨酸3.663.52赖氨酸5.895.46丙氨酸4.163.72脯氨酸4.524.31结氨酸4.404.22精氨酸6.837.30蛋氨酸0.720.74胱氨酸1.361.18异亮氨酸4.364.14色氨酸0.991.02氨基酸总量88.1785.80
2.3 致敏性评价试验
类胰蛋白酶是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是临床上检验人体是否过敏的重要指标[9-10]。受肥大细胞活化剂BAPNA作用后，斑马鱼会产生过敏反应，诱导肥大细胞分泌类胰蛋白酶。类胰蛋白酶的OD值与类过敏反应程度成正相关。斑马鱼致敏性试验结果见表4。
表4 致敏性评价实验结果
Table 4 Experimental results of sensitization evaluation
组别质量浓度/(μg·mL-1)OD值正常对照组-0.202±0.037 发酵大豆蛋白肽粉55.60.116±0.010∗∗∗167.00.085±0.007∗∗∗500.00.094±0.018∗∗∗
注：***，P<0.001，相对于正常对照组极显著差异
由表4可知，发酵大豆蛋白肽粉55.6、167、500 μg/mL质量浓度组OD值分别为0.116、0.085、0.094，与正常对照组相比具有极其显著性差异，分别降低了43%、58%、53%，说明发酵大豆蛋白肽粉在一定浓度范围内不会诱发类过敏反应，降低致敏性风险同时可能存在抗敏性。
2.4 肌肉保护试验
由图1可知正常对照组斑马鱼肌肉细胞呈均一长条状，且横纹清晰，模型对照组肌纤维松弛，但未见浸润和坏死，乳清蛋白及发酵大豆蛋白肽粉处理组肌纤维纹理清晰、结构紧密，与正常对照组较为相似，具有明显的肌肉保护功效。
a-正常对照组；b-模型对照组； c-乳清蛋白组102.3 μg/mL；d-发酵大豆蛋白肽组102.3 μg/mL
图1 斑马鱼肌肉保护试验病理切片图
Fig.1 Pathological section of zebrafish muscle protection test
由表5可知，模型对照组相比于正常对照组具有极其显著性差异，说明造模成功。乳清蛋白组及发酵大豆蛋白肽组相对模型对照组具有极显著性差异，说明乳清蛋白和发酵大豆蛋白对斑马鱼都具有肌肉保护作用。乳清蛋白组相对发酵大豆蛋白肽粉组没有显著性差异，说明发酵大豆蛋白肽粉对肌肉保护作用效果等同于乳清蛋白。
表5 肌肉保护试验结果汇总表
Table 5 Summary of muscle protection test results
样品组别质量浓度/(μg·mL-1)长度清晰度松弛度浸润度坏死度总分正常组/000000模型对照组/03.0±0 4.0±0 007.0±0∗∗ 乳清蛋白102.301.0±0.71.2±0.4002.2±0.8&&发酵大豆蛋白肽粉102.301.8±0.81.0±0.7002.8±1.3&&
注：总分0分为正常；1～4分轻度肌肉损伤；5～6分为中度肌肉损伤；7分及以上为重度肌肉损伤；**，相对于正常组极显著差异；&&，相对于模型对照组极显著差异；(P<0.01)
3 结论
发酵大豆蛋白肽粉以大豆分离蛋白为原料，通过现代生物“酶膜耦合”定向酶解和复合菌种发酵技术精制而成，富含整蛋白、多肽、低聚肽、有机酸等活性成分。体外消化试验显示发酵大豆蛋白肽粉相对大豆分离蛋白在胃、肠道消化率均有提高，李世成等[11]研究发现相对补充大豆分离蛋白，补充大豆低聚肽具有更高的表观消化率、储存率和净氮利用率，与本文结论相似。致敏性评价结果显示发酵大豆蛋白肽粉致敏性降低，在一定浓度下不会诱发致敏性反应，具有抗过敏性作用，可能机理为大豆分离蛋白通过酶解和发酵破坏了原料蛋白过敏原的构象表位和线性表位，弱化过敏信号通路，有效降低了致敏风险，与前人研究结果一致[12-13]。乳清蛋白富含支链氨基酸尤其是亮氨酸，且乳清蛋白属于快膳食蛋白[14]，是被认为抵抗肌肉衰减最有效的蛋白质之一，对肌肉具有较强保护作用[15]，多个研究表明乳清蛋白在增肌，促进肌肉合成方面优于大豆蛋白[16-19]。但长期补充乳清蛋白质可能会对肠道微生物群产生负面影响[20]。本实验肌肉保护实验显示发酵大豆蛋白肽粉具有肌肉保护作用，同时具有低致敏性，其在预防老年肌肉衰减产品及运动增肌产品应用前景广阔。
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