豆豉是我国历史悠久的传统发酵豆制品，根据制曲过程中微生物的不同分为曲霉型、毛霉型、细菌型和根霉型4种豆豉[1]。传统永川豆豉是毛霉型豆豉的代表，其豉香浓郁、乌黑油亮、质地入口化渣，一直深受消费者的喜爱。但是传统永川豆豉是通过接种空气中的微生物自然发酵，受环境、季节等多种因素的影响大，发酵周期长达1年[2]，不利于工业化生产。利用曲霉制曲和低盐高温发酵技术生产的速成永川豆豉能将后发酵时间缩短为30 d左右，大大提高了生产效率。但速成永川豆豉工艺缩短发酵周期的同时也会导致豆豉的香气不足。杨洋等[3]通过Flash Profile法发现传统永川豆豉和速成永川豆豉的感官性质存在显著差异。众多学者发现传统永川豆豉的挥发性物质的种类与含量均高于速成永川豆豉[4-6]。因此，提高速成永川豆豉风味物质的种类和含量对解决其香气不足的问题具有重要意义。
与速成永川豆豉相比，传统永川豆豉在制曲和后发酵过程中具有更丰富的微生物物种组成[7]，其中酵母[8-9]对传统永川豆豉的风味具有重要作用。例如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)有利于酯类和醇类化合物的产生[10]，是东北地区传统发酵豆酱中的优势酵母[11]。鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)有利于酯类、醇类及吡嗪类化合物的产生，具有甜香、麦芽香等香气特征，可用于提高酱油的香气品质[12]。此外，多种酵母混合发酵更有利于特征风味物质的增加，Z. rouxii与季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)混合发酵能够产生更多的醇类、呋喃酮类、酯类等特征风味物质[13]。因此，后发酵过程中缺失酵母是速成永川豆豉香气不足的重要原因，但目前关于酵母对豆豉香气影响的研究还很少。
本研究基于前期对不同菌株单一发酵、混合发酵速成永川豆豉的增香效果，用鲁氏接合酵母和汉逊德巴利酵母对速成永川豆豉等比例混合发酵工艺进行优化，通过感官定量描述分析(quantitative description analysis，QDA)和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技术探究嗜盐芳香酵母在不同发酵条件下对速成永川豆豉香气特征和风味物质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
速成永川豆豉，重庆永川豆豉有限公司。
试剂：麦芽汁培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基，北京索莱宝科技有限公司；NaCl，重庆跃翔化工有限公司；1,3-二氯苯标准品(纯度99.7%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国。
菌株：鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06均由本实验室从重庆永川豆豉有限公司传统永川豆豉中分离鉴定保藏。
1.2 仪器与设备
US1709M012气相色谱质谱(GC-MS)联用仪、HP-5色谱柱，Agilent公司；57330-U手动固相微萃取进样器、顶空固相微萃取纤维头(50/30 DVB/CAR/PDMS)，美国Supelco公司；JJ-2BS组织捣碎机，常州峥嵘仪器有限公司；数显恒温水浴锅，常州奥华仪器有限公司；AJ31002精密电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 速成永川豆豉的二次发酵
将Z. rouxii ZR21接种在含80 g/L NaCl的麦芽汁培养基中，D. hansenii DH06接种在含80 g/L NaCl的YPD培养基中，28 ℃培养3 d。在高、中、低温度(35、20和10 ℃)下菌种等比例混合，以高、低2种浓度接种(105和106 CFU/kg)，二次发酵速成永川豆豉30、45 d，具体工艺见表1。
表1 永川豆豉样品信息
Table 1 Information of Yongchuan Douchi samples
编号发酵条件Control速成永川豆豉L11低温自然发酵30 d,低浓度接种L12低温自然发酵30 d,高浓度接种L21低温自然发酵45 d,低浓度接种L22低温自然发酵45 d,高浓度接种M11中温自然发酵30 d,低浓度接种M12中温自然发酵30 d,高浓度接种M21中温自然发酵45 d,低浓度接种M22中温自然发酵45 d,高浓度接种H11高温自然发酵30 d,低浓度接种H12高温自然发酵30 d,高浓度接种H21高温自然发酵45 d,低浓度接种H22高温自然发酵45 d,高浓度接种
1.3.2 感官分析
1.3.2.1 样品准备
称取10 g豆豉样品盛放在30 mL一次性带盖透明塑料杯中，3位随机数字编码。
1.3.2.2 感官评价过程
参考文献[14-15]的方法，7名经过培训的感官评价人员通过18种市售豆豉和12种嗜盐芳香酵母发酵豆豉建立豆豉香气描述词。首先感官评价人员独立产生豆豉香气描述词。然后感官评价小组合并意思相近词语，删除含义模糊、带有感情色彩词语，形成一致的豆豉香气描述词及其定义。按照GB/T 29604—2013《感官分析 建立感官特性参比样的一般导则》的方法，选择适合中国消费者的产品作为参比样，并对参比样的强度达成共识。
感官评价小组根据建立的豆豉香气描述词对12种嗜盐芳香酵母发酵豆豉和速成永川豆豉的香气进行定量描述分析。每次试验评价3～4个豆豉样品，时长约为1.5 h。评价1个样品后，评价人员通过嗅闻温热的湿毛巾缓解嗅觉疲劳，休息5 min后评价下一个样品。采用0～15分值打分制，0表示无，15表示非常强[16-17]。
1.3.3 挥发性成分的测定[5-6]
1.3.3.1 顶空固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)
称取3 g豆豉样品，粉碎后放入15 mL固相微萃取样品瓶中，加入30 μL标准品1,3-二氯苯(10.0 μg/mL)，加盖密封。在60 ℃水浴锅中平衡20 min，插入CAR/DVB/PDMS萃取纤维，萃取30 min，将萃取纤维在GC进样口250 ℃下解吸5 min，进行GC-MS分析。
1.3.3.2 挥发性成分测定
色谱条件：Hp-5非极性毛细管柱；柱初温40 ℃，以2 ℃/min的速率升到80 ℃，保持2 min，以2.5 ℃/min的速率升温到140 ℃，保持1 min，以8 ℃/min的速率升温到250 ℃；进样口温度250 ℃，溶剂延迟5 min，不分流；载气为氦气；流量为1.0 mL/min。
质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；电压350 V；接口温度230 ℃；扫描范围m/z 25～400。
1.3.3.3 定性定量方法
定性分析：采用NIST library谱库检索比对进行定性。
定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标物为1，3-二氯苯。含量按公式(1)计算：
(1)
式中：ci,未知化合物含量，ng/g；Si,未知化合物峰面积；S,内标物峰面积；c,内标物浓度，μg/mL；V,内标物体积，μL；m,样品质量，g。
1.3.3.4 香气活性值(odor activity value，OAV)
OAV按公式(2)计算：
(2)
式中：ci，挥发性成分的含量，ng/g；OTi，挥发性成分在参考文献中的香气阈值，mg/kg。
1.4 数据分析
利用Microsoft Office Excel 2010对样本所得数据进行整理计算，采用IBM SPSS Statistic 25分析软件进行单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)；XLSTAT 2019进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。
2 结果与分析
2.1 感官评价结果
2.1.1 豆豉香气特征词的建立
经过15次时长1.5 h的评价单元，感官评价小组对豆豉香气特征词进行开发、合并、删减，最终建立了10个香气特征词，见表2。
表2 豆豉香气特征词的定义和参比样
Table 2 Definitions and references of aroma characteristics terms for Douchi
感官属性定义参比样=香气强度豉香一种豆豉特有的整体风味特征,往往具有咸香、鲜香、发酵味、豆味等风味特征传统永川豆豉=13酱香酱油或者甜面酱的香气,往往具有咸和轻微发酵的气味[18]加加红烧老抽=13鲜香一种鲜味物质所产生的气味佳仙鸡精溶液(0.25 g/L)=9酒香由谷物发酵而得的酒产生的一种以乙醇为主题的混合气味特征[14]精制江津白酒∶水(1∶9)=11酸香一种与酸味物质相关的气味[14]加加白醋∶水(1∶4)=9豆味豆制品的香味[19]煮熟黄豆=9烟味一种由木材熏制而产生的特定风味[14]4-乙基愈创木酚(320 mg/mL)=7甜香一种与甜味物质相关的气味[14]红糖溶液(15 g/L)=9霉味一种带有泥土味的不新鲜感觉,类似霉菌和潮湿的土或地下室散发出的气味[20]香菇根=9中药味与中药相关的气味[21]藿香正气口服液(4 mL/L)=7
2.1.2 永川豆豉香气特征方差分析
对QDA结果进行单因素方差分析和多重比较分析发现(表3)，与速成永川豆豉相比，嗜盐芳香酵母发酵豆豉的豉香、酸香强度显著增强(P<0.05)，酱香、豆味、霉味强度显著降低(P<0.05)，而在高温、低浓度菌种的条件下发酵30 d更有利于其香气特征的变化。
表3 永川豆豉定量描述分析结果
Table 3 Results of quantitative descriptive analysis of Yongchuan Douchi
香味对照M11M12M21M22L11L12L21L22H11H12H21H22豉香5.21±0.65a7.04±1.13def6.21±0.99bc6.36±0.61bcd5.96±0.61bc5.71±0.72ab6.25±0.53bc6.11±0.71bc6.61±0.63cde7.64±0.72f7.21±1.82ef7.29±0.86ef6.14±0.89bc酱香7.79±1.93e7.29±0.80de6.71±0.90bcd6.93±0.70cde5.89±0.66ab7.00±0.65cde7.21±0.77de5.96±0.30ab5.68±0.55a7.86±1.20e7.43±1.80de6.25±1.03abc6.64±1.11bcd鲜香5.21±1.37def4.50±0.60abcd4.07±0.59ab4.86±0.99bcde4.21±0.56ab4.39±0.85abcd3.96±0.13a3.64±0.79a4.32±1.13abc6.43±0.84g5.14±1.92cdef5.50±0.85ef5.93±0.80fg酒香4.43±0.73cd4.11±0.54bcd3.93±0.59abc3.93±0.82abc4.61±0.66de3.36±0.48a3.39±0.60a3.79±0.41ab3.71±1.41ab5.21±0.67e5.21±1.06e5.07±0.88e5.14±1.19e酸香3.64±0.81ab3.79±0.56abc3.43±0.56a4.14±0.83bcd3.64±0.48ab3.68±0.52ab3.68±0.52ab4.14±0.61bcd4.32±0.55cd4.43±0.90d3.29±0.80a3.86±0.65abc4.61±0.47d豆味4.86±0.83cd3.54±0.48ab3.79±0.41ab3.43±0.49a3.61±0.43ab4.18±0.59abc4.07±0.73ab3.75±0.49ab3.71±0.56ab5.79±1.01e5.29±1.79de4.86±1.06cd4.21±0.99bc烟味4.21±0.75cdef4.54±0.48defg4.86±0.74g3.64±0.61abc4.64±0.52fg3.46±0.57ab3.93±0.78bcd3.93±0.62bcd4.00±0.65bcde3.79±1.15bc4.57±0.49efg3.11±0.60a4.50±0.73defg甜香3.86±0.64b3.43±0.49ab3.36±0.48ab3.64±0.44ab3.57±0.53ab3.50±0.50ab3.36±0.44ab3.32±0.45a3.32±0.45a4.39±0.71c3.43±0.65ab3.36±0.58ab3.82±0.79ab霉味6.21±1.15e4.29±0.59abc3.96±0.55a4.21±1.10ab4.68±0.82abc4.00±1.07a5.00±0.60cd4.39±0.47abc4.36±0.72abc5.54±0.85d4.21±0.56ab4.89±0.89bcd5.50±1.12d中药味4.71±0.70cd4.04±0.55b3.86±0.61ab3.43±0.49a4.29±0.31bc4.14±0.72b4.29±0.52bc3.79±0.36ab4.00±0.38b4.71±0.88cd4.71±0.59cd3.82±0.84ab4.96±0.90d
注：同一行不同字母表示在P<0.05水平上具有显著差异
2.1.3 永川豆豉香气特征PCA
对QDA法的结果进行PCA，如图1所示，嗜盐芳香酵母发酵豆豉均与速成永川豆豉发生偏离。与高温发酵豆豉相比，嗜盐芳香酵母在中温和低温条件下发酵的豆豉香气特征更相似，可能是由于高温条件下细菌活性增强，酵母发酵受到一定抑制；但低温发酵需要更高的菌种浓度，可能是由于低温条件下酵母活性较低。与发酵30 d相比，嗜盐芳香酵母发酵45 d更有利于香气特征变化。
图1 永川豆豉PCA图
Fig.1 Principal component analysis of Yongchuan Douchi
2.2 永川豆豉挥发性成分分析[17]
挥发性成分是评价豆豉香气的重要指标。本实验通过SPME-GC-MS共检测出64种挥发性成分(见附录)，包括9种酸类、9种醛类、12种酯类、5种酮类、3种醇类、4种酚类、9种吡嗪类、2种呋喃类、9种烃类和2种其他物质。由此看出，豆豉挥发性成分主要由酸类、醛类、酯类、吡嗪类和烃类物质构成。与速成永川豆豉相比，嗜盐芳香酵母发酵豆豉的酸类、醛类、酯类、酮类、醇类、吡嗪类、呋喃类及其他挥发性成分含量整体呈增加趋势，大多烃类物质含量呈减少趋势。
2.3 永川豆豉香气活性物质分析
一般认定，当挥发性化合物的OAV≥1时对食品香气具有一定贡献作用，且OAV越大，其贡献作用越大。速成永川豆豉共有6种OAV≥1的挥发性成分，而嗜盐芳香酵母发酵的豆豉则有7～12种。由表4可知，嗜盐芳香酵母提高了速成永川豆豉中异戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、异戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈创木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7种OAV≥1的挥发性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异己酸乙酯、辛酸乙酯、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。
异戊酸和3-甲基戊酸被认为是豆类发酵品中香气的重要贡献物质，提供酸味和哈喇味[22]。2-甲基丁醛、异戊醛和苯乙醛提供麦芽香和蜂蜜味[23]，可能为豆豉香气提供积极影响。乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异己酸乙酯、辛酸乙酯等酯类物质被描述为果香或者花香味[24]，酯类物质与酵母发酵作用有密切联系，酵母降解脂质发生酯化反应。同时乙酸乙酯也是传统永川豆豉特有的主要风味物质[6]。2-十一酮提供水果香[25]，可能为豆豉提供甜香。愈创木酚是烟熏味、熏烤味香气化合物的典型代表[14]，为酱油提供烟熏味[12]，因此，愈创木酚可能与豆豉中烟味有关。2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪等吡嗪类物质提供坚果香[26]；2-戊基呋喃具有绿豆、黄油味[27]，在与其他香气活性物质的共同作用下对豆豉香气产生积极影响。二甲基三硫具有硫味或洋葱味，多次在酱油、豆瓣酱等发酵食品中检测到[22]，表明该物质为发酵豆制品中的关键香气物质。因此，嗜盐芳香酵母发酵的豆豉能有效增加速成永川豆豉中风味物质的种类和含量。
表4 永川豆豉中挥发性成分的阈值和OAV
Table 4 Threshold and OAV of volatile components in Yongchuan Douchi
分类挥发物名称阈值/(mg·kg-1)[28-29]OAVControlM11M12M21M22L11L12L21L22H11H12H21H22酸类3-甲基戊酸0.0461.37<12.96-1.201.79<1<1<12.45<11.631.59异戊酸0.49<1<1<1<1<1<11.03<1<1<1<1<1<1醛类2-甲基丁醛0.001-2.88-4.92----11.71----异戊醛0.000 542.729.46344.405.72111.30701.02380.0632.2235.28303.4296.00228.88317.26苯甲醛0.75<1<1<1<1<11.04<1<1<1<1<1<1<1苯乙醛0.006 323.3432.5353.7723.3639.3458.6756.55-18.4958.6452.9849.3051.55酯类乙酸乙酯0.032-<11.48<1<1----2.091.131.61-2-甲基丁酸乙酯0.000 013----881.54---500.00402.31-786.92217.69异己酸乙酯0.000 003--31 216.6723 566.6732 073.33-----23 073.3331 350.0036 616.67辛酸乙酯0.019 3---------2.241.351.321.36酮类2-十一酮0.005 51.053.792.613.954.842.512.213.012.972.412.492.742.85酚类愈创木酚0.000 8422.0215.4627.2717.0234.1939.2928.3725.8844.0038.4840.5240.7953.13吡嗪类2-乙基-6-甲基吡嗪0.04<1-<1-1.13<1-<11.01---<12-乙基-3,6-二甲基吡嗪0.008 6<11.431.601.531.501.741.541.44-1.826.621.711.662-异丙基-3-甲氧基吡嗪0.000 004----2 762.50--3 375.006 835.00----呋喃类2-戊基呋喃0.005 86.8431.6545.7727.2724.5543.8155.4043.8338.9853.0949.5945.3448.29其他二甲基三硫0.000 1---------227.80236.20219.30149.50
注：“-”表示未检测出
3 结论
通过对不同条件下嗜盐芳香酵母发酵豆豉的感官定量描述分析可知，嗜盐芳香酵母发酵豆豉的豉香、酸香强度显著增强(P<0.05)，酱香、豆味、霉味强度显著降低(P<0.05)，且最佳发酵条件为35 ℃，接种量105 CFU/kg，发酵时间30 d。
通过对不同条件下嗜盐芳香酵母发酵豆豉的挥发性成分分析可知，嗜盐芳香酵母提高了速成永川豆豉中异戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、异戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈创木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7种OAV≥1的挥发性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异己酸乙酯、辛酸乙酯、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。因此，嗜盐芳香酵母增加了对豆豉香气具有贡献作用的挥发性成分的含量及组成。
综上所述，通过添加鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06进行二次发酵是实现速成永川豆豉増香的有效途径。
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