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透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸为双糖单位重复串联而成的直链酸性黏多糖，2020年全球销售额达680亿元人民币。透明质酸的生物学功能和特异性应用取决于其分子质量，高分子透明质酸（分子质量范围1.8 M～2.2 MDa）结构稳定，常用于生物医学领域；中分子透明质酸（1.0 M～1.8 MDa）可以保持关节润滑，长久保湿，在骨关节炎治疗中有显著疗效；小分子透明质酸（400 k～1.0 MDa）能渗入真皮，扩张毛细血管，主要用于化妆品领域。目前，透明质酸产量不论在发酵水平还是分子水平都已达到瓶颈，仅仅在透明质酸产量上的提升不利于透明质酸的推广应用，为扩大透明质酸的应用范围以及制备更好的生物医学、保健产品，对于调控透明质酸分子质量大小的研究非常重要，这也是近年来学者们的研究重点。

内容简介

高分子量透明质酸具备优异的细胞保护性能，同时具有更为优秀保湿和抵抗炎症的生理功能，本研究的主要目的在于如何提高合成透明质酸分子量。利用优化的透明质酸提纯方法，设计定向进化突变位点，并通过途径基因强化强化前体物质合成，均取得良好效果。

本研究首先在食品级表达宿主谷氨酸棒杆菌中表达多杀性巴斯德杆菌来源透明质酸合酶基因（pmhasA），经过密码子和透明质酸提取方法优化，透明质酸分子量达到 1.51 MDa。其次，通过理性改造透明质酸合酶编码基因（pmhasA T104A），透明质酸分子量 提高至 1.8 MDa。进一步通过强化代谢途径中 UDP-葡萄糖脱氢酶基因（ugdA），透明质酸分子量提高至 3.3 MDa。在此基础上优化最适培养温度为 20°C，摇瓶中透明质酸分子量最高为 4.8 MDa。最后在 3 L 发酵罐进行分批补料发酵，高分子量透明质酸产量达到 1.5 g/L。本文通过透明质酸合酶改造、代谢途径调控和代谢途径强化实现了高分子量透明质酸的安全、高效合成，为高分子量透明质酸的生产奠定了基础。

图文导读

提取胞内透明质酸方法流程图

本文探究比较了传统的透明质酸提取方法—高温高压破壁法和高压匀浆法与碱裂解法所提取的透明质酸分子量上的差异。结果显示采用高温高压和高压匀浆条件下会破坏透明质酸原有的链长，造成长链断裂，影响最终透明质酸分子量测定的结果；而采用更为温和的碱裂解提取法破壁处理菌体，更有利于获得高分子量的透明质酸。

将透明质酸合酶主要分为4个区域如图c所示，分别为N端区域、UDP-GlcNAc糖基转移酶区域、UDP-GlcUA糖基转移酶区域和C端区域，并进行截短分析。重组菌pmHasAΔ2-45、pmHasAΔ2-71和pmHasAΔ2-95合成的透明质酸分子量相比重组菌pmHasA下降6%、10%和17%；重组菌pmHasAΔ2-117产量相比出发菌株pmHasA下降81%，分子量下降了48%。重组菌表达截短704-972位氨基酸透明质酸合酶突变体时合成的透明质酸分子量仅下降7%。图b结果为重组菌发酵液在相位差显微镜下的镜检图，重组菌pmHasAΔ2-117菌体难以发现透明质酸的积累，经测得透明质酸产量仅为0.02 g/L；而在重组菌pmHasAΔ704-972中我们可以发现明显的透明质酸积累，表明透明质酸合酶pmHasA 704-972位点的氨基酸对合成的透明质酸产量和分子量没有明显影响。因此我们推测透明质酸合酶pmHasA中96-117氨基酸对合成透明质酸的分子量和产量有显著影响，而2-95位及704-972位氨基酸对于透明质酸的合成及分子量影响相对较小。

强化透明质酸合成途径常用于提高透明质酸合成链长。在过表达透明质酸合酶突变体 pmhasA T104A 的基础上，通过质粒 pEC-XK99E 分别单独强化表达谷氨酸棒杆菌内源代谢途径基因 galU、ugdA、glmS、 glmM 和 glmU。结果如图所示，当分别强化 UDP-GlcUA 前体物质的途径基因 galU、ugdA 时，合成透 明质酸的分子量相比重组菌 T104A 提高了 41%和 84%；而强化 UDP-GlcNAc 前体合成的途径基因 glmS、 glmU 时，合成透明质酸的分子量相比重组菌 T104A 降低了 11%和 16%。表明在谷氨酸棒杆菌中，前体 物质 UDP-GlcUA 显著影响透明质酸链长，其中过表达 ugdA 效果最为明显，透明质酸分子量达到 3.31 MDa。

本文作者：汪昊, 王阳, 胡立涛, 康振, 堵国成

原文链接：http://sf1970.cnif.cn/CN/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.027184

团队介绍

江南大学生物系统与生物加工工程研究室 由中国工程院院士伦世仪教授领衔建于1982年，主要从事代谢工程与合成生物学、食品微生物学、生物过程优化与控制、分子及应用酶学等方向的研究。研究室目前正在承担或完成包括国家重点研发计划项目、“973”项目、“863”重点项目在内的国家和省部级项目以及企业委托项目100余项。相关研究成果发表在Nat. Commun.、Trends Biotechnol.、Microbiol. Mol. Biol. R.、Metab. Eng.等本领域国际权威刊物。获得发明专利授权200余项，其中国际专利21项。作为第一单位获国家技术发明二等奖2项、国家科技进步二等奖1项。

供 稿丨汪   昊

编 辑丨王馨甜

排 版丨宋冰冉

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