L-酪氨酸是多种有价值的次级代谢产物的通用前体。地衣芽胞杆菌中芳香族氨基酸合成是通过莽草酸途径进行,但代谢调控的潜在机制仍不清楚。该研究对地衣芽胞杆菌合成酪氨酸过程中莽草酸途径代谢节点进行挖掘。通过发酵优化、提升细胞摄氧能力、荧光定量PCR检测途径基因转录水平、多个节点基因的不同组合方式过表达以及莽草酸补加等策略,对莽草酸途径代谢节点进行挖掘。在最优发酵条件下,重组菌HGPA合成酪氨酸单位菌体产量可以达到71 mg/L。荧光定量PCR结果表明,vgb基因的过表达后aroC和aroD基因转录水平分别是原始菌的2.57和2.91倍,酪氨酸单位菌体产量从71 mg/L提升至100 mg/L,提升了40.8%。在HGPA的基础上分别过表达基因aroC,aroD和aroK,其中HGPAD与HGPAK重组菌酪氨酸合成量可以达到1 200 mg/L。发酵过程中补加5 g/L莽草酸时,HGPA与HGPAK的酪氨酸合成分别可以达到1 311和1 490 mg/L。aroD和aroK是地衣芽胞杆菌合成酪氨酸过程中莽草酸途径的重要代谢节点。aroD和aroK的过表达可以提升L-酪氨酸的合成但是不能彻底解除节点代谢流的限制。该研究为进一步实现地衣芽胞杆菌工业生产L-酪氨酸及其高价值衍生物的应用潜能奠定了基础。

黑曲霉(Aspergillus niger)是食品工业中重要的生产菌株,广泛应用于酶和有机酸生产。为提高黑曲霉遗传操作效率,对黑曲霉转化及重组菌株筛选策略进行优化。基于已报道的最佳转化条件对黑曲霉AG11进行电转化、农杆菌介导和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化(Agrobacterium-mediated and PEG-mediated transformation,PMT),单个潮霉素转化板分别得到0、30和6个转化子。其中,PMT的转化子阳性率最高。基于优化后的原生质体制备条件:0.8~1 g松散的菌丝球于10 mL Yatalase溶液(0.8 mg/mL,pH 5.5)反应2.5 h,获得原生质体并进行PMT,转化效率较优化前提高14倍。为提高转化子筛选效率,将融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的天冬酰胺酶(asparaginase,ASN)基因整合至黑曲霉AG11糖化酶位点,并通过流式细胞仪分选表达ASN的孢子。分选结果显示,0.3%的孢子能表达GFP(共筛选30万个孢子)。酶活力分析表明,65%表达GFP的孢子能表达ASN。研究结果将为黑曲霉基因编辑提供重要方法学基础。

便秘(constipation)是一类常见的胃肠道疾病,其发病率呈逐年上升的趋势。临床研究发现,便秘患者肠道菌群失调。通过赋予机体一定量的活性益生菌来调节肠道菌群,已然成为治疗便秘的重要手段。因此,该研究选取2株具有不同缓解便秘效果的副干酪乳杆菌进行研究。通过对便秘相关指标的检测,再次证实仅有来源于健康成人粪便中的副干酪乳杆菌LPC-F具有缓解便秘的作用。进一步通过对便秘相关胃肠调节肽、血清中炎症因子、结肠Cajal间质细胞的数量、肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸等指标进行检测,解析副干酪乳杆菌LPC-F缓解便秘的可能方式。结果表明副干酪乳杆菌LPC-F可能通过改变肠道菌群的结构,提高肠道内乙酸的水平,乙酸则通过刺激肠嗜铬细胞释放5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),释放入肠腔的5-HT通过与其受体相结合,促进结肠Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal, ICC)的增殖,从而最终增强肠蠕动缓解便秘。

胶原蛋白是结缔组织中一种重要蛋白质,具有抗皱、抗老化和补钙壮骨的功效,在食品工业中应用广泛。由于胶原蛋白的需求量大,因此利用重组微生物生产胶原蛋白成为近年来的研究热点。该文采用重组有类人胶原蛋白基因的毕赤酵母,通过优化培养基成分,使其在无机盐培养基中表达胶原蛋白。首先,类人胶原蛋白在每24 h补加体积分数1.5%甲醇诱导120 h后的产量可达18.87 mg/L,进而将无机盐培养基中盐浓度降至1/3,有效避免了类人胶原蛋白的水解,也减少了重组毕赤酵母菌株分泌的杂蛋白量。进一步添加1 g/L L-脯氨酸等辅助营养物使类人胶原蛋白的产量提高至40.26 mg/L,为初始类人胶原蛋白表达量的2倍。结果表明,添加氨基酸等氮源能显著提高重组毕赤酵母的类人胶原蛋白分泌量,为重组类人胶原蛋白的发酵生产提供了指导。

该研究基于宏基因组学技术对3种香型白酒大曲微生物群落及其功能特征进行解析,采用顶空固相微萃取气质联用(headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry)检测大曲风味物质,并通过关联性分析探究微生物与风味间的联系。结果表明3种大曲菌群结构具有显著差异,线性判别分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)揭示浓香型大曲特征细菌属和真菌属为Bacillus和Lichtheimia、Saccharomyces,其中高丰度的Bacillus有利于四甲基吡嗪和2,3-丁二醇的生成;清香型大曲特征菌群以Lactobacillus、Weissella等产酸细菌属和产酯真菌属Pichia组成,使得清香型大曲中酯类风味物质含量显著高于其他大曲。酱香型大曲特征细菌属和真菌属分别为Desmospora、Saccharopolyspora和Byssochlamys、Aspergillus等。基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome)功能注释可知3种大曲参与碳水化合物代谢与氨基酸代谢的功能基因最多且均存在显著差异。在3种大曲中,清香型大曲微生物在碳水化合物代谢比例最高,而酱香型大曲中氨基酸代谢比例最高。该研究阐明了3种大曲微生物菌群结构差异以及核心产香微生物,为后续筛选功能微生物与开发功能型强化酒曲提供了理论基础。

微生物胞外多糖具有多种有益特性,是潜在的益生元。胞外多糖BPS-2是从苏云金芽孢杆菌IX-01通过高密度发酵后提取出来的。BPS-2是一种由氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖组成的杂多糖,摩尔比为5.53∶1.77∶4.74∶3.24∶1,其多糖分子质量为27.96 kDa。该研究通过四唑盐试验法对BPS-2的细胞毒性进行了评价,在验证了其多糖无细胞毒性的前提下,采集了10位健康人粪便微生物,探究BPS-2对人体粪便菌群组成及代谢产物的影响。在体外进行48 h的静态发酵时,与阴性对照相比,BPS-2明显增强了短链脂肪酸的产生(P＜0.05),乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸的浓度分别达到(31.59±0.73)、(10.82±0.65)、(8.18±0.2)和(50.59±1.54)mmol/L。通过16S rRNA基因测序表明BPS-2可以显著增加有益菌属Parabacteroides的相对丰度,并减少有害微生物菌群Megamonas和Fusobacterium的相对丰度,进而参与改善宿主肠道微生物区系的结构。这是关于苏云金芽孢杆菌生产的BPS-2体外益生特性的首次报告,为其在食品工业中的应用提供了基础。

为对乳酸菌食品中的污染菌进行计数和鉴定,采用MRS琼脂对6种乳酸菌粉和12种市售乳酸菌食品中的乳酸菌进行计数,同时用平板计数琼脂(plate count agar,PCA)、不含糖的计数琼脂(count agar sugar free, CASF)对上述样品中的菌落总数和非乳酸菌进行计数。对PCA和CASF平板上的菌落,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)进行鉴定。数据显示,乳酸菌粉的乳酸菌计数结果为3.2×10¹⁰～4.7×10¹⁰CFU/g,PCA和CASF平板上没有菌落生长。12种市售乳酸菌食品的乳酸菌计数结果均高于10⁶CFU/g。MALDI-TOF MS鉴定发现,PCA上的菌落既有乳酸菌,又有非乳酸菌;乳酸菌不能在CASF平板上形成菌落,在CASF平板上生长的菌落,经鉴定均为非乳酸菌,属于乳酸菌食品中的污染菌。采用不含糖的计数琼脂CASF结合MALDI-TOF MS鉴定技术,可迅速准确对乳酸菌食品中污染菌进行计数和鉴定。

粪肠球菌Gr17(Enterococcus faecalis Gr17)是从白酒酒醅中分离的高产细菌素的菌株,该研究以Gr17为研究对象,筛选可正向调控细菌素合成的营养胁迫条件,并初步探究该条件正向调控细菌素合成的具体机制。以MRS培养基为对照,测定在1/4 MRS、1/2 MRS和3/4 MRS的营养胁迫条件下,该菌生长及细菌素产量的变化,并采用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)测定群体感应调控中与细菌素合成相关基因的表达水平。结果表明,随初始营养物质的减少,菌体生长密度减小。但发现1/4 MRS的胁迫条件下菌株细菌素产量显著上升。RT-qPCR结果显示,在1/4 MRS的胁迫条件下,细菌素结构基因ent I、ent J和ent Gr17,ABC转运系统调节基因AS-48E、AS-48F、AS-48G、AS-48H,自诱导肽基因AIP以及双组分调节基因hpk和rr的表达均显著上调(P＜0.05)。因此,营养胁迫对粪肠球菌Gr17的生长不利,但1/4 MRS的胁迫条件可正向调控细菌素合成,且受群体感应系统调控。该研究期望为营养胁迫对细菌素合成的调控机制相关研究提供参考。

为探究发酵乳杆菌LFQ153胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)对RAW264.7巨噬细胞氧化损伤的保护作用与机制,该研究以DPPH自由基和羟自由基清除能力研究EPS的体外抗氧化水平。通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞建立氧化损伤模型,以抗氧化酶活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和NO含量,及炎症因子表达为指标,研究EPS对细胞氧化损伤的保护作用。以Nrf2/HO-1/NF-κB通路相关基因表达水平,探讨EPS保护细胞氧化损伤的作用机制。此外,该研究采用离子色谱分析EPS的单糖组成。结果表明, EPS的DPPH自由基和羟自由基清除率分别为(64.19±1.03)%和(61.87±3.09)%。与LPS处理组相比,EPS可显著提高巨噬细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力,降低MDA和NO含量,以及诱导型一氧化氮激酶、肿瘤坏死因子-α、白介素1β和白介素6的mRNA表达水平。并且,EPS促进氧化损伤巨噬细胞中Nrf2和HO-1的mRNA表达,抑制NF-κB的活化。此外,结构分析表明EPS由盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成,摩尔比为2.48∶10.26∶50.22∶8.16。该研究表明,EPS可以保护巨噬细胞氧化损伤,且这种保护作用与Nrf2/HO-1/NF-κB通路的调节及EPS的单糖组成有关。

鱼胶为鱼鳔干制品,既是富含蛋白质的滋补食物,也是一味名贵中药材,在治疗滑精、创伤出血、疮毒肿痛等方面具有良好功效。国内外学者对鱼胶的研究主要集中在胶原蛋白的提取、生物活性肽的制备与特性研究等技术领域。鱼胶食品目前仍以初加工为主,多以干制品的形式出现在市场上,产品开发仍不够成熟。文章总结了常见鱼胶种类,简述了鱼胶的基本营养成分及含量,即鱼胶是一种胶原蛋白丰富、脂肪含量少的药食同源食品;概述了鱼胶现今的发展状况,指出其行业规模在逐年扩大,具有强大的市场竞争力;并阐述了目前鱼胶产品质量参差不齐、缺少对应标准规范的现状。以期为鱼胶在食品加工领域的应用和创新,以及鱼胶标准的制订提供理论依据。

结冷胶寡糖由结冷胶降解所得,具有益生活性、植物诱导抗病性等多种生物学功能,其制备意义重大。该研究通过构建重组毕赤酵母以实现结冷胶裂解酶异源表达,并应用于裂解结冷胶制备结冷胶寡糖。重组菌株经筛选鉴定,首先于摇瓶水平诱导表达结冷胶裂解酶,获得酶活力最高为266.4 U/L的菌株;随后在7 L发酵罐中进行高密度发酵,酶活力达954.6 U/L。对重组结冷胶裂解酶进行分离纯化并研究其酶学性质,结果表明,酶促降解反应最适催化温度和pH分别为45 ℃和7.5,在45~50 ℃和pH 7.0~9.0下稳定,Zn²⁺对酶活性略有促进作用,Al³⁺对酶促反应具有较强的抑制作用。通过薄层色谱法联用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析降解产物,该结冷胶寡糖聚合度为4。该研究首次在毕赤酵母中成功表达Bacillus sp.GL1来源结冷胶裂解酶,特异性降解结冷胶制备寡糖,具有一定的工业应用潜力和指导意义。

多糖和蛋白质是食品中最重要的2种功能大分子,可以通过相互作用形成复合水凝胶。与单一组分相比,多糖和蛋白质形成的复合水凝胶不仅具有优异的物理结构和化学性质,而且具有提高复合体系机械性能的潜在优势。该文对部分多糖-蛋白质复合水凝胶的研究进展进行总结,综述了形成复合水凝胶的多糖及蛋白质的类型和条件、二者主要相互作用及影响二者相互作用的内部和外部因素,阐述了多糖对其与蛋白质形成复合水凝胶机械性能的影响,并概述了多糖-蛋白质复合水凝胶在食品工业及生物医药等领域的应用现状。该文将为多糖-蛋白质基创新凝胶的设计、开发及应用提供理论参考依据。

工程酵母菌发酵过程中因氧化胁迫、蛋白质错误折叠等压力致使生产能力降低。该研究发现,在甲羟戊酸途径增强的酵母工程菌中,过表达人源细胞凋亡调控因子B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)和还原型谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase,GSH1)编码基因可以促进橙花叔醇的合成,橙花叔醇摇瓶产量分别提高77.7%和32.7%,达到594.1和446.9 mg/L。对表达和未表达BCL-2蛋白的菌株进行代谢组学分析,发现了182种差异代谢物,主要涉及脂肪酸代谢、氨基酸代谢以及辅酶A和泛酸的生物合成等。此外,发现连接有内质网定位信号肽的BCL-2蛋白对工程菌产橙花叔醇的促进作用更强,橙花叔醇摇瓶产量进一步提高了29.2%,达到767.6 mg/L。该研究为提高外源萜类化合物在工程酿酒酵母中的产量提供了一个有效的策略。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种多功能乳酸菌,所产胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)具有很多优良功能特性。但发酵生产EPS时,原料和操作成本高,EPS产量低限制了其工业化应用。该研究在5 L罐中,使用常规流加发酵、生物催化、生物催化结合液液萃取和基于pH-Stat自动流加葡萄糖法的反复生物催化等策略发酵,旨在提高EPS产量、降低原料和操作成本。其中,生物催化法仅使用葡萄糖即可将EPS质量浓度提升至3.34 g/L,较摇瓶发酵水平提高110%。使用基于pH-Stat自动流加葡萄糖法的反复生物催化策略,可以连续回用各反复发酵中的残存细胞,第2次反复发酵批次的EPS质量浓度达到3.33 g/L。由于在收集处理细胞时,细胞总量下降,导致EPS产量下降,但EPS/细胞量不变,细胞活性稳定。可以通过加大首批次发酵的装液量、提高细胞总量,解决EPS产量不断下降的问题。用基于pH-Stat法的反复生物催化策略进行EPS发酵,提升了EPS产量,省去了昂贵MRS培养基的使用,降低了原料成本,实现了自动化控制。该发酵策略还可联产具有一定价值的副产物40 g/L DL-乳酸。

为构建新型表面活性肽的表达载体,并探讨其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化,将编码新型活性肽A₆K的重复DNA片段(A₆K)₁₅分别插入到4中不同的原核表达载体中,经酶切和测序验证后,转化到3种不同的表达宿主进行表达,通过改变异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度、诱导温度和时间来优化表达条件。表达产物通过镍-次氮基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)螯合层析进行纯化,通过(A₆K)₁₅上的6×His与抗体特异性结合进行Western blot分析,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定产物浓度,进行经济效益分析。构建了含有目的基因(A₆K)₁₅的重组表达质粒,筛选出最优载体pET-28a-SUMO-(A₆K)₁₅和最优宿主BL21(DE3)。当IPTG终浓度为1.0 mmol/mL,诱导温度为30 ℃,时间为12 h时,表面活性肽(A₆K)₁₅的表达量最高,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定含有此新型小分子多肽(A₆K)₁₅。该研究成功构建了新型表面活性肽(A₆K)₁₅表达载体,并得到其最优表达条件,使其大量表达及纯化,为生物方法制备新型表面活性肽提供了思路。

为科学配伍肠道健康食品中的益生菌与益生元,在相同的体外培养条件下评价乳双歧杆菌BL-99、婴儿双歧杆菌YLGB-1496、副干酪乳杆菌K56、副干酪乳杆菌ET-22等4株益生菌对12种益生元的利用特点,高通量筛选典型的合生元组合并分析其发酵特性。研究通过微生物菌落自动化工作站测定所有组合的生长速率,初步筛选特征组合,并与市售典型益生菌乳双歧杆菌BB-12和鼠李糖乳杆菌LGG对照,评价特征组合中益生元对益生菌的促增殖及促产酸能力,并通过益生元降解率和代谢产物分析评价其体外发酵特性。以代谢产物作为主要指标,结果显示不同益生元对益生菌的作用效果差异显著,乳双歧杆菌BL-99与乳糖组合的益生效果较好,而婴儿双歧杆菌YLGB-1496、副干酪乳杆菌K56、副干酪乳杆菌ET-22则与低聚半乳糖组合的益生效果较好。该研究通过高通量组合筛选,为益生菌与益生元的组合提供数据支持,为肠道健康食品开发奠定基础。

鱼是日常膳食结构的重要组成部分,具有较高的营养价值。但是,在贮存过程中,由于鱼体组织结构脆弱以及内源性酶和嗜冷细菌的作用,导致鱼的气味、风味和质地发生变化,鱼体品质迅速下降。因此,快速、方便、无损检测鱼体新鲜度成为目前该领域的研究热点。该文在对比与总结传统鱼体新鲜度检测方法的基础上,简述了目前最新的鱼体新鲜度检测方法,包括气味指纹技术、新鲜度指示型智能包装技术、蛋白组学分析技术、生物传感器技术和光谱技术,比较和论述了其优缺点,并对其发展前景和应用趋势进一步展望。

D-泛酸是一种B族维生素,广泛应用于饲料、食品、医药等行业。由于化学法合成D-泛酸的成本高、环境污染大,采用生物发酵法生产D-泛酸显得尤为重要。为了实现重组大肠杆菌DPA21/pBCST3D的高产,在5 L发酵罐水平进行了发酵参数的优化,并在补料分批发酵实验中对β-丙氨酸和葡萄糖的流加方式和浓度进行优化,进一步提高了D-泛酸的产量。通过优化确定了培养条件为温度30 ℃、pH 6.8、溶氧15%;β-丙氨酸补料方式为与葡萄糖混合且质量浓度为40 g/L,通过比较2种不同的葡萄糖流加方式,最终选择以脉冲式5～10 g/L的补料方式进行。在以上的发酵条件下,D-泛酸的产量达到41.5 g/L,较初始条件下提高了41.3%。研究结果为D-泛酸的工业化生产奠定了基础。

将不同浓度的天然菊粉(inulin,IN)与小麦淀粉(wheat starch,WS)进行复配,制备IN-WS复配体系,研究复配体系的糊化、流变、消化等理化特性,并分析IN与WS间的相互作用。结果表明,复配体系的黏度、崩解值和回生值显著降低,IN的添加抑制了复配体系的糊化,使WS更加稳定;IN-WS复配体系均为典型的非牛顿流体,具有剪切稀释行为;随着IN浓度的增加,IN-WS复配体系的凝胶结构逐渐由类固态向类液态转变。此外,体外消化试验结果表明,复配体系抗性淀粉的含量随着IN浓度的增高而增大。由相互作用力及红外光谱分析可知,IN与WS的相互作用主要涉及分子间氢键。该研究可为菊粉-淀粉基食品的开发与应用提供指导。

金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)是一种具有类似天然酶活性的纳米材料,已被开发成比色传感器,特别是基于AuNPs过氧化物酶活性的比色方法被广泛应用于分析检测领域。该文介绍了AuNPs的合成方法,总结了基于AuNPs过氧化物酶活性比色传感器的检测原理,列举了其在食品安全检测中的应用实例,最后就目前存在的问题提出建议,并对未来的发展前景进行了展望。