李妍, 刘闪闪, 肖灵, 曹禹萱, 白小佳, 王金菊, 贾龙刚, 王艳萍, 耿伟涛
该研究利用类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELP)标签和分子黏合剂“SpyTag/SpyCatcher”建立了快速高效的乳糖酶分离纯化方法,并研究了获得的重组乳糖酶(lactase-elastin-like polypeptides,Lac-ELP)的酶学性质及其在合成低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)中的应用。从产马乳酒乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)ZW3中克隆得到乳糖酶酶基因lac,并将lac连接到“Spytag”标签,在大肠杆菌DH5α中表达获得了含有Spytag的乳糖酶Lac-Spytag。通过基因合成获得了编码ELP的基因片段elp,并将elp接到“Spycatcher”编码基因的下游,在大肠杆菌DH5α中表达获得了含有SpyCatcher的ELP标签SpyCatcher-ELP。随后,通过SpyTag和SpyCatcher的自发连接,将Lac-SpyTag和SpyCatcher-ELP进行融合,获得重组乳糖酶Lac-SpyTag-SpyCatcher-ELP(Lac-ELP)。利用ELP标签的可逆相变循环技术,对Lac-ELP进行分离纯化,成功获得了分子质量大小为115 kDa的Lac-ELP,回收效率为73.8%。随后,比较ELP标签对Lac活性的影响。Lac-ELP和Lac的最适温度均为50 ℃,最适pH值均为7.0,但Lac-ELP比Lac表现出更好的热稳定性和pH稳定性。最后,以乳糖为底物研究了Lac-ELP在制备GOS中的应用。结果表明,Lac-ELP表现出较好的转糖苷活性,底物浓度400 mg/mL,Lac-ELP添加量10 U/g乳糖,35 ℃反应24 h后,GOS产率可达33.23%。综上,该研究建立的基于ELP的乳糖酶纯化技术操作简便,成本低,可以快速获得高活性的重组乳糖酶,为GOS的工业合成提供参考。